《KJ 202101 食品中赭曲霉毒素A的快速檢測 膠體金免疫層析法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。

食品快速檢驗方法犓犑２０２１０１食品中赭曲霉毒素犃的快速檢測膠體金免疫層析法２０２１０１１３發(fā)布國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布

1犓犑２０２１０１食品中赭曲霉毒素犃的快速檢測膠體金免疫層析法１范圍本方法規(guī)定了食品中赭曲霉毒素Ａ的快速檢測膠體金免疫層析法。本方法適用于谷物（燕麥除外）、葡萄酒、烘焙咖啡豆、研磨咖啡（烘焙咖啡）和速溶咖啡中赭曲霉毒素Ａ的快速測定。２原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理，樣品中的赭曲霉毒素Ａ經提取與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制了抗體和試紙條中檢測線（Ｔ線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線（Ｔ線）與控制線（Ｃ線）顏色深淺比較，對樣品中赭曲霉毒素Ａ進行定性判定。３試劑與材料３．１試劑除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，實驗用水為ＧＢ／Ｔ６６８２規(guī)定的二級水。３．１．１甲醇。３．１．２乙腈。３．１．３無水乙醇。３．１．４鹽酸。３．１．５三羥甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ堿）。３．１．６氯化鈉。３．１．７氯化鉀。３．１．８磷酸氫二鈉。３．１．９磷酸二氫鉀。３．２試劑配制３．２．１甲醇乙腈（５０＋５０）：分別量?。担埃恚碳状迹ǎ常保保ⅲ担埃恚桃译妫ǎ常保玻?，混合均勻。３．２．２鹽酸溶液（１＋１）：量?。担埃恚帖}酸（３．１．４）緩慢倒入４０ｍＬ水中，定容至１００ｍＬ，混勻。３．２．３谷物稀釋液：稱取Ｔｒｉｓ堿（３．１．５）２４２．２８ｇ，加入６００ｍＬ水，充分攪拌溶解后用鹽酸溶液（３．２．２）將ｐＨ值調節(jié)至８．０，向溶液中加入氯化鈉２０ｇ（３．１．６）充分攪拌至溶解，加水定容至１Ｌ，或使用膠體金免疫層析檢測試劑盒配套稀釋液。３．２．４葡萄酒稀釋液：稱?。裕颍椋髩A（３．１．５）２４２．２８ｇ，加入６００ｍＬ的水，充分攪拌溶解后，用鹽酸溶液（３．２．２）將ｐＨ值調節(jié)至７．５，向溶液中加入氯化鈉（３．１．６）２０ｇ，充分攪拌至溶解，加水定容至１Ｌ?；蚴褂媚z體金免疫層析檢測試劑盒配套稀釋液。３．２．５咖啡復溶液：分別稱取氯化鈉（３．１．６）１６０．０ｇ、氯化鉀（３．１．７）４．０ｇ、磷酸氫二鈉（３．１．８）７１．６ｇ、磷１

2犓犑２０２１０１酸二氫鉀（３．１．９）４．８ｇ于１０００ｍＬ燒杯中，加水充分攪拌溶解后轉移至１０００ｍＬ容量瓶中定容。取上述溶液５０ｍＬ加入９５０ｍＬ水混合均勻，即為咖啡復溶液?；蚴褂媚z體金免疫層析檢測試劑盒配套復溶液。３．３標準品赭曲霉毒素Ａ標準品：純度≥９９％，或經國家認證并授予有證標準物質證書的標準物質。其中文名稱、英文名稱、ＣＡＳ號、分子式、相對分子質量見表１。表１赭曲霉毒素犃的中文名稱、英文名稱、犆犃犛號、分子式、相對分子質量中文名稱英文名稱ＣＡＳ號分子式相對分子質量赭曲霉毒素ＡＯｃｈｒａｔｏｘｉｎＡ３０３４７９Ｃ２０Ｈ１８ＣｌＮＯ６４０３．８１３．４標準溶液配制３．４．１赭曲霉毒素Ａ標準儲備溶液（１００μｇ／ｍＬ）：準確稱取適量的赭曲霉毒素Ａ標準品（３．３）于燒杯中溶解后轉移至１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇乙腈（５０＋５０）（３．２．１）溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成１００μｇ／ｍＬ的赭曲霉毒素Ａ標準儲備液。在－２０℃保存，可使用３個月。３．４．２赭曲霉毒素Ａ標準工作液Ａ（１μｇ／ｍＬ）：準確量取赭曲霉毒素Ａ標準儲備溶液（１００μｇ／ｍＬ）（３．４．１）１ｍＬ，置于１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇乙腈（５０＋５０）（３．２．１）稀釋至刻度，搖勻。于４℃避光保存，可使用７天。３．４．３赭曲霉毒素Ａ標準工作液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）：準確量取赭曲霉毒素Ａ標準工作液Ａ（１μｇ／ｍＬ）（３．４．２）１０ｍＬ，置于１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇乙腈（５０＋５０）（３．２．１）稀釋至刻度，搖勻。臨用現(xiàn)配。３．５材料赭曲霉毒素Ａ膠體金免疫層析試劑盒：金標微孔（含膠體金標記的特異性抗體）、試紙條。需在陰涼、干燥、避光條件下保存。４設備與儀器４．１電子天平：感量分別為０．０１ｇ和０．１ｍｇ。４．２粉碎機。４．３渦漩混合器。４．４離心機：≥４０００ｒ／ｍｉｎ。４．５移液器：１００μＬ、２００μＬ、１ｍＬ、５ｍＬ。４．６氮吹儀。４．７ｐＨ計。４．８篩網：０．５ｍｍ～１ｍｍ孔徑。５環(huán)境條件環(huán)境溫度：１５℃～３０℃；相對濕度：≤８０％。２

3犓犑２０２１０１６分析步驟６．１試樣制備谷物、烘焙咖啡豆：取具有代表性樣品約１ｋｇ，用高速粉碎機將其粉碎，全部通過０．５ｍｍ～１ｍｍ孔徑試驗篩，過篩，混合均勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣和留樣，密封，標記。焙烤咖啡、速溶咖啡：取具有代表性樣品約１ｋｇ，混合均勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣和留樣，密封，標記。葡萄酒：取代表性樣品混合均勻。６．２試樣提?。叮玻惫任餃蚀_稱取試樣５ｇ（精確至０．０１ｇ），置于５０ｍＬ離心管中，依次加入２０ｍＬ水，１ｍＬ谷物稀釋液（３．２．３），渦漩混勻１ｍｉｎ后靜置３０ｍｉｎ，４０００ｒ／ｍｉｎ離心３ｍｉｎ，上清液即為待測液。６．２．２葡萄酒吸?。矗埃唉蹋淘嚇佑冢担恚屉x心管中，依次加入１１６０μＬ水，４０μＬ葡萄酒稀釋液（３．２．４），渦漩混勻３０ｓ后靜置３０ｍｉｎ，混勻后的液體即為待測液。６．２．３烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡準確稱取試樣１ｇ（精確至０．０１ｇ），置于１５ｍＬ離心管中，加入８ｍＬ無水乙醇（３．１．３），渦漩混勻１ｍｉｎ后靜置３０ｍｉｎ，４０００ｒ／ｍｉｎ離心３ｍｉｎ。取１ｍＬ上清液，于５０℃水浴中氮氣吹干。烘焙咖啡豆、焙烤咖啡加入０．５ｍＬ咖啡復溶液（３．２．５），速溶咖啡加入１ｍＬ咖啡復溶液（３．２．５），渦漩混勻１ｍｉｎ，作為待測液。注：試樣提?。ǎ叮玻┻^程可按照試劑盒說明書操作。６．３測定步驟吸取２００μＬ上述待測液于金標微孔中，抽吸至孔底顆粒完全溶解，室溫條件下進行孵育：谷物孵育３ｍｉｎ，葡萄酒孵育３ｍｉｎ，烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡孵育４ｍｉｎ。將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標微孔中，室溫條件下谷物反應３ｍｉｎ，葡萄酒反應６ｍｉｎ，烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡反應４ｍｉｎ。從微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，觀察顯色情況，進行結果判定。若試劑盒冷藏保存，使用前需恢復至實驗環(huán)境溫度。注：測定步驟（６．３）也可按照試劑盒說明書進行。６．４質控試驗每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。６．４．１空白試驗稱取空白試樣，按照６．２和６．３步驟與樣品同法操作。６．４．２加標質控試驗谷物樣品：準確稱取空白樣品５ｇ（精確至０．０１ｇ）置于５０ｍＬ具塞離心管中，加入２５０μＬ赭曲霉毒３

4犓犑２０２１０１素Ａ標準中間液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）（３．４．３），使谷物中赭曲霉毒素Ａ濃度為５μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步驟與樣品同法操作。烘焙咖啡豆、焙烤咖啡樣品：準確稱取空白樣品１ｇ（精確至０．０１ｇ）置于１５ｍＬ具塞離心管中，加入５０μＬ赭曲霉毒素Ａ標準中間液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）（３．４．３），使焙烤咖啡豆、焙烤咖啡中赭曲霉毒素Ａ濃度為５μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步驟與樣品同法操作。速溶咖啡樣品：準確稱取空白樣品１ｇ（精確至０．０１ｇ）置于１５ｍＬ具塞離心管中，加入１００μＬ赭曲霉毒素Ａ標準中間液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）（３．４．３），使速溶咖啡中赭曲霉毒素Ａ濃度為１０μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步驟與樣品同法操作。７結果判定通過對比質控線（Ｃ線）和檢測線（Ｔ線）的顏色深淺進行結果判定，見圖１目視判定示意圖。７．１無效控制線（Ｃ線）不顯色，無論檢測線（Ｔ線）是否顯色，表明操作不正確或試紙條已失效，檢測結果無效。７．２陽性結果控制線（Ｃ線）顯色，檢測線（Ｔ線）不顯色或顏色淺于控制線（Ｃ線），表明樣品中赭曲霉毒素Ａ高于方法檢測限，判為陽性。７．３陰性結果控制線（Ｃ線）顯色，檢測線（Ｔ線）顏色深于控制線（Ｃ線）或與控制線（Ｃ線）顏色基本一致，表明樣品中赭曲霉毒素Ａ低于方法檢測限，判為陰性。圖１目視判定示意圖４

5犓犑２０２１０１７．４質控試驗要求空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。８結論本方法篩查出的陽性樣品應按照ＧＢ２７６１指定方法標準進行確證。９性能指標９．１檢出限谷物為５μｇ／ｋｇ；葡萄酒為２μｇ／ｋｇ；烘焙咖啡豆、焙烤咖啡為５μｇ／ｋｇ；速溶咖啡為１０μｇ／ｋｇ。９．２靈敏度靈敏度≥９５％。９．３特異性特異性≥９５％。９．４假陰性率假陰性率≤５％。９．５假陽性率假陽性率≤５％。注：性能指標計算方法見附錄Ａ。１０其他本方法分析步驟和結果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進行，但應符合或優(yōu)于本方法規(guī)定的性能指標。本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規(guī)定的各項性能指標時方可使用。本方法參比標準為ＧＢ５００９．９６—２０１６《食品安全國家標準食品中赭曲霉毒素Ａ的測定》（包括所有的修改單）。５

6犓犑２０２１０１附錄犃（規(guī)范性）定性方法性能指標計算表定性方法各個性能指標計算見表Ａ．１。表犃．１定性方法性能指標計算表檢測結果ｂ樣品情況ａ總數(shù)陽性陰性陽性犖１１犖１２犖１．＝犖１１＋犖１２陰性犖２１犖２２犖２．＝犖２１＋犖２２總數(shù)犖．１＝犖１１＋犖１２犖．２＝犖２１＋犖２２犖＝犖１．＋犖２．或犖．１＋犖．２顯著性差異（χ２）χ２＝（｜犖１２－犖２１｜－１）２／（犖１２＋犖２１），自由度（犱犳）＝１靈敏度（狆＋）／％狆＋＝犖１１／犖１．×１００特異性（狆－）／％狆－＝犖２２／犖２．×１００假陰性率（狆犳）／％狆犳－＝犖１２／犖１．×１００＝１００－靈敏度假陽性率（狆犳＋）／％狆犳＋＝犖２１／犖２．×１００＝１００－特異性相對準確度ｃ／％（犖１１＋犖２２）／（犖１．＋犖２．）×１００注：犖：任何特定單元的結果數(shù)，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：犖１１表示第一行，第一列；犖１．表示所有的第一行，犖．２表示所有的第二列；犖１２表示第一行，第二列。ａ樣品中實際的公議值結果。ｂ赭曲霉毒素Ａ膠體金試紙條得到的結果。靈敏度的計算使用確認后的結果。ｃ為方法的檢測結果相對準確性的結果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。本方法起草單位：山東省食品藥品檢驗研究院。本方法驗證單位：北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心（北京市食品檢驗所）、廣東省食品檢驗所、安徽省產品質量監(jiān)督檢驗研究院、山東食安檢測技術有限公司、國家糧食和物資儲備局、河南省口岸食品檢驗檢測所。本方法主要起草人：田洪蕓、張海紅、王駿、畢婷婷、胡梅、任雪梅、葉金。６