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附件13食品中玉米赤霉烯酮快速檢測膠體金免疫層析法征求意見稿1.范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中玉米赤霉烯酮快速檢測膠體金免疫層析法。本標(biāo)準(zhǔn)適用玉米、小麥及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速篩選測定。第一法比色法2.原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線（T線）、控制線（C線）的顏色深淺對比進(jìn)行結(jié)果判讀。3.試劑及材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為GB/T6682規(guī)定的二級水。3.1.試劑3.1.1.乙腈。3.1.2.甲醇+水（7+3，體積比）。3.1.3.稀釋緩沖液（膠體金免疫層析檢測試劑盒專用提取液或根據(jù)產(chǎn)品使用說明書配置）。3.2.參考物質(zhì)3.2.1.玉米赤霉烯酮的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1，純度≥95%。表1玉米赤霉烯酮參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量玉米赤霉烯酮Zearalenone17924-92-4C18H22O5318.36注：或等同可溯源物質(zhì)。3.3.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3.3.1.標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈（3.1.1）溶解，制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。﹣18℃避光保存，有效期6個月。

11.1.1.標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/mL）（3.3.1）100μL，置于10mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1μg/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，2～8℃避光保存，有效期1個月。1.2.材料玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試劑盒，適用基質(zhì)為玉米、小麥及其碾磨加工品。2.儀器和設(shè)備2.1.移液器：100μL、200μL、1mL和5mL。2.2.旋渦混合器。2.3.離心機(jī)。2.4.電子天平：感量為0.01g。3.環(huán)境條件環(huán)境溫度：20～30℃?？諝庀鄬穸龋鹤罴褱y定濕度45%～65%。若濕度低于45%，相應(yīng)延長待測液-試紙條反應(yīng)時間，以質(zhì)控實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)；若濕度為65%～80%，微孔與試紙條拆開后立即使用，避免微孔與試紙條長時間暴露在空氣中受潮，避免高濕環(huán)境下（濕度80%以上）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.分析步驟4.1.試樣制備取適量樣品，充分碾磨或粉碎混勻，過40目篩。4.2.提取準(zhǔn)確稱取試樣5.0g（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入20mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3min，離心分層或靜置分層，上清液備用。準(zhǔn)確移取0.8mL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5mL離心管中，加入25μL上清液，混勻，待檢。4.3.測定步驟依檢驗(yàn)所需，取相應(yīng)數(shù)量的金標(biāo)微孔和試紙條，做好標(biāo)記。吸取待檢液200μL于金標(biāo)微孔中，抽吸至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，孵育10min。將試紙條插入金標(biāo)微孔中，反應(yīng)3min～5min。從金標(biāo)微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，觀察顯色結(jié)果，進(jìn)行判定。（若試劑盒冷藏保存，使用前需恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境溫度。）5.質(zhì)控試驗(yàn)每批樣品應(yīng)該同時進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽性質(zhì)控試驗(yàn)。5.1.空白試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取空白試樣，按照6.1和6.2步驟與樣品同法操作。5.2.陽性質(zhì)控試驗(yàn)

2準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60μg/kg的質(zhì)控樣，按照6.1和6.2步驟與樣品同法操作?；驕?zhǔn)確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60μg/kg，按照6.1和6.2步驟與樣品同法操作。1.結(jié)果判定通過對比控制C線和檢測T線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。1.1.無效結(jié)果無論樣品中有無玉米赤霉烯酮存在，C線都會出現(xiàn)一條紫紅色條帶。若控制C線未顯色，表明操作過程不正確或試紙條已失效，檢測結(jié)果無效。無效圖1試紙條目視判定圖1.2.陽性結(jié)果控制C線顯色，檢測T線顯色比C線淺或者沒有顏色，判定為陽性。1.3.陰性結(jié)果控制C線顯色，檢測T線顯色比C線深或者一致，判定為陰性。比色法圖2試紙條目視判定圖1.4.質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性，陽性質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陽性。

3第二法消線法1.原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過T線顯色與否進(jìn)行判讀結(jié)果。2.試劑及材料同3。3.儀器和設(shè)備同4。4.環(huán)境條件環(huán)境溫度：10～40℃。空氣相對濕度：同5。5.分析步驟5.1.試樣制備同6.1。5.2.提取準(zhǔn)確稱取試樣5.0g（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入12.5mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3min，離心分層或靜置分層，上清液備用。準(zhǔn)確移取400μL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5mL離心管中，加入上清液(小麥50μL，玉米80μL），混勻，待測。5.3.測定步驟同6.3。6.質(zhì)控試驗(yàn)同7。7.結(jié)果判定通過檢測T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。7.1.無效同8.17.2.陽性結(jié)果控制C線顯色，檢測T線不顯色，判定為陽性。7.3.陰性結(jié)果控制C線顯色，檢測T線顯色，判定為陰性。

4消線法圖3試紙條目視判定圖1.質(zhì)控試驗(yàn)要求同8.42.結(jié)論本方法篩查出的陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)時，應(yīng)按GB2761指定方法標(biāo)準(zhǔn)檢測并判定。3.性能指標(biāo)3.1.檢出限：60μg/kg。3.2.靈敏度：靈敏度≥95%。3.3.特異性：特異性≥90%。3.4.假陰性：假陰性≤5%。3.5.假陽性：假陽性≤10%。注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。4.其他本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進(jìn)行考察，滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)時方可使用。本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB5009.209-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中玉米赤霉烯酮的測定。

5附錄A快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算表樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N21N.2=N12+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異（c2）c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；b由玉米赤霉烯酮膠體金試紙條檢驗(yàn)方法得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標(biāo)指行，第二個下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。C為方法的檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。本方法起草單位：成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院。本方法參與單位：江南大學(xué)、國家糧食局科學(xué)研究院、廣東省食品檢驗(yàn)所、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院。本方法主要起草人：肖全偉、姚蕾珺、王昕、張敏、胥傳來、田洪蕓、沈泓、周露