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1、大規(guī)模蛋白表達（）簡介（）蛋白質(zhì)是行使生物學功能的最重要的一類分子。利用包括生物化學和生物物理學，特別是結(jié)構(gòu)生物學等手段對蛋白質(zhì)的研究，需要大量的高純度的蛋白。利用異源表達宿主來表達重組蛋白是目前最常用的一種方式。蛋白表達系統(tǒng)有很多種，比較常用的有原核表達系統(tǒng)（大腸桿菌）和真核表達系統(tǒng)（如酵母、昆蟲細胞或者哺乳動物細胞）。不同的表達系統(tǒng)各有優(yōu)缺點，而不同的蛋白對表達系統(tǒng)的要求也不同。這里僅介紹大腸桿菌表達系統(tǒng)。常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)大多采用,它可以結(jié)合和的原件，對其控制的基因表達做調(diào)控。通常，目的蛋白的表達可以用過添加（比如）來實現(xiàn)。更多關(guān)系表達

2、載體的信息，請參見載體部分。材料（）o試劑（）ü培養(yǎng)基ü抗生素（根據(jù)載體抗性而定）ü（細菌用，其他用。如果發(fā)現(xiàn)不夠用時這樣配：稱至無菌玻璃瓶，加入無菌水，搖至完全溶解即可。極易溶于水。一般一部分分裝到管，剩余倒在離心管保存在℃即可。注：由于冰的密度為，而水的密度是，所有需要凍在冰箱里的一切溶液都不要裝滿，否則會炸裂。）短期大規(guī)模使用情況下，可以不用分裝，保存在℃冰箱便于使用。ü：,,,ü:,,,ü:,,o實驗前準備（）ü確保以上試劑夠用ü大量干凈的短玻璃管，實現(xiàn)用蒸餾水沖一遍并烘干ü高壓滅菌的玻璃量筒（細菌時用）ü?jié)饪s管（）在威紅姐座位上面的柜子

3、里。注意不一樣的（常用，，，），選擇小于蛋白一半的。比如的蛋白，用不大于的濃縮管。o器械（）離心機（使用前預(yù)冷至℃），金屬煮樣器，真空泵，上樣泵，純化儀實驗步驟（）搖菌?1.先挑一點甘油凍存保種細菌至含有抗生素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)大半天。（5/5小時內(nèi)一定要變渾，否則之后即使變渾濁也可能不是你要的細菌。做甘油凍存的時候細菌狀態(tài)要好，濃度要高。加入甘油以后要混勻。注意盡量避免反復(fù)凍融甘油凍存菌。）1.將菌液轉(zhuǎn)移至或者中，℃培養(yǎng)過夜?！P(guān)鍵步驟：如果表達量很高的蛋白一般足矣，因此轉(zhuǎn)至中；而表達量較低的蛋白需要，因此轉(zhuǎn)至中。大規(guī)模培養(yǎng)?1.向培養(yǎng)基中加入抗

4、生素（稀釋至），以及（每升中加）和葡萄糖（每升中加－）。添加是為了提高細菌的生長速度和狀態(tài)，而添加葡萄糖是為了抑制泄露表達，因為它是通過降低宿主細菌內(nèi)的（激活因子，增加的表達）的水平來實現(xiàn)的。2.用無菌的玻璃量筒將過夜培養(yǎng)的菌液平分至升中。3.搬到℃搖床中搖，搖至值為（需要約小時）?！P(guān)鍵步驟：一般把手放在錐形瓶下方，如果你透過菌液看不到自己手時可以去測了。4.由于實驗室大搖床降溫速度較慢，提前開始降溫至℃。冷卻半小時后加入?！P(guān)鍵步驟：如果是()需要的，其他菌種的即可。誘導時間一般小時足矣，其他特殊蛋白需要過夜誘導，根據(jù)情況而定。5.提前預(yù)冷離

5、心機。把菌液倒入離心機配套的塑料筒中，一共有個筒，如果只要種蛋白就不用寫蛋白的名稱，但是如果搖好幾種蛋白時一定要貼上標簽（不要直接用比寫在上面，如果擦不干凈日積月累上面就會滿滿的字，不僅看著丑，而且再往上寫你自己也不知道到底哪個是你的字）。根據(jù)液面配平，×離心?！P(guān)鍵步驟：如果兩種蛋白時，三個筒放一種蛋白，三個筒放另一個蛋白，這樣雖然一次離不完，但也不用中間再洗這些筒。吸菌液做樣品，純化之前先確保蛋白表達與否。6.準備干凈的大勺和小藥匙，每升產(chǎn)生細菌比較正常。金屬燒杯提前稱好，貼上標簽紙寫明目的蛋白以及燒杯的重量。測濕重可以知道是否有融菌等異常。

6、7.離心之后將上清直接倒干凈，用勺把細菌從上面摳下來，再用藥匙把細菌從大勺轉(zhuǎn)移到金屬燒杯中。先放在冰上?！P(guān)鍵步驟：兩種蛋白時一定要看好蛋白名稱，千萬不要弄混。8.同樣的方法，將剩余的菌液全部離心，最后稱金屬燒杯和細菌的總重量，減量法計算濕重。9.離心筒和勺上會殘留一些細菌，用將剩余的細菌沖下來倒入燒杯中，用鋁箔紙封口，暫時放在℃／℃冰箱?！P(guān)鍵步驟：一般幾級別的蛋白足矣，能用搞定的蛋白不需要。純化蛋白超聲?1.先把金屬燒杯從冰箱拿出來，放在溫水中解凍。根據(jù)細菌濕重加入，，用小藥匙攪拌均勻?？梢杂么帕嚢枳愚D(zhuǎn)一會。解凍可以加快。盡量保持細菌在低溫

7、，不要在溫水中放太長時間，防止蛋白質(zhì)的降解。如果觀察到蛋白有部分降解現(xiàn)象，要從裂解液開始的所有里加()。2.將燒杯至于冰中進行超聲破碎。參數(shù)：，，破碎，停止，約分鐘左右。超聲儀探頭放在液面下－處，離底不能太近。如果放在太靠上會產(chǎn)生很多氣泡。超聲至菌液稀如水，沒有絲毫粘稠物?！P(guān)鍵步驟：超聲儀參數(shù)按個人習慣可以調(diào)，但不要超聲太久，菌會焦掉，等離心的時候沉淀中有黑色的東西就說明超聲太久了。5/5純化蛋白離心、過濾?1.提前換的轉(zhuǎn)子，換成裝離心管的小轉(zhuǎn)子，預(yù)冷離心機至℃。以后我們把小轉(zhuǎn)子倒置放在度冰箱預(yù)冷。2.將菌液倒入離心管，配平，×離心。上清倒入小

8、燒杯中。3.將過濾用的濾器組裝好，注意不要漏了，接上真空泵，把收集瓶放在冰上預(yù)冷。將濾膜貼在細孔上，用盡量少的潤濕，并把旋蓋擰緊。打開泵