《哺乳細(xì)胞蛋白表達(dá)案例》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、哺乳細(xì)胞蛋白表達(dá)案例1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊钥蛻籼峁┑哪康牡鞍谆驑?gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)哺乳表達(dá)體系獲得目的蛋白X。2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）分析客戶提供的目的蛋白序列，設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)方案；（2）選擇鐘鼎特色載體pAZ-V5，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pAZ-V5-X；（3）轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)，通過(guò)WesternBlot檢測(cè)蛋白X是否表達(dá)；（4）通過(guò)Ni柱純化獲得目的蛋白X，SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白純度，BSA方法測(cè)定蛋白濃度。3.蛋白分析（1）經(jīng)EditSeq翻譯目的蛋白X序列：m.w.=39.27kd，pI=8.52（2）經(jīng)UniProt匹配，蛋白X物種

2、來(lái)源：草魚(yú)（3）目的基因稀有密碼子分析及蛋白結(jié)構(gòu)分析目的基因稀有密碼子分析蛋白親疏水分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析結(jié)果：①目的基因不含哺乳表達(dá)體系稀有密碼子。②目的蛋白整體呈親水性、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域、無(wú)信號(hào)肽序列。結(jié)論：將目的基因構(gòu)建在鐘鼎特色載體pAZ-V5上，利用載體自帶信號(hào)肽分泌表達(dá)，并在目的蛋白C端添加His標(biāo)簽便于純化。1.表達(dá)載體構(gòu)建1.1pAZ-V5-X質(zhì)粒酶切驗(yàn)證：鐘鼎特色載體pAZ-V5酶切鑒定Marker:250,500,750,1000,1500,2000,2500,3000,4000,5000,6000,

3、8000,12000Line1:酶切前質(zhì)粒Line2:酶切后質(zhì)粒基因名稱：X（OD260/OD280:1.82）酶切位點(diǎn)：EcoRI/BamHI4.2pAZ-V5-X質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證：部分序列比對(duì)結(jié)果圖1.蛋白表達(dá)及純化純化蛋白WesternBlot鑒定分析M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1:純化蛋白蛋白表達(dá)WesternBlot鑒定分析M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1:細(xì)胞裂解上清2:細(xì)胞上清3:細(xì)胞裂解上清（陰性）4:細(xì)胞上清（陰性）純化蛋白XSDS-PAGE膠灰度值分析純化蛋白XSDS-PAGE(reduced)分析M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1:純化蛋白

4、2.蛋白內(nèi)毒素檢測(cè)凝膠半定量試驗(yàn)：平行管供試品稀釋倍數(shù)陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)終點(diǎn)稀釋倍數(shù)Log10平均值Log10-11:21:41:81:161:321:641+------+1:2（0.5）-0.301-0.3010.5（1：2）2+------+1:2（0.5）-0.301純化蛋白內(nèi)毒素濃度=鱟試劑靈敏度λ×反應(yīng)終點(diǎn)稀釋倍數(shù)的幾何平均值=0.03EU/ml×2=0.06EU/ml1.實(shí)驗(yàn)結(jié)論目的蛋白X在293F細(xì)胞中得到表達(dá)，并且經(jīng)過(guò)Ni柱純化蛋白純度（SDS-PAGE膠灰度值）到達(dá)99%，純化蛋白內(nèi)毒素含量為0.06EU/ml。