《曼氏無(wú)針烏賊Hsp70克隆及序列分析【開(kāi)題報(bào)告】》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、畢業(yè)論文開(kāi)題報(bào)告水產(chǎn)養(yǎng)殖曼氏無(wú)針烏賊Hsp70克隆及序列分析一、選題的背景與意義熱休克蛋白是生物體內(nèi)與抗逆相關(guān)的一類(lèi)十分重要的蛋白。除高溫誘導(dǎo)外，許多損傷因素、應(yīng)激刺激（如缺血、缺氧、重金屬離子、氨基酸類(lèi)似物、病毒感染、DNA損傷、自由基等）作用后，都可以導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生熱休克反應(yīng)（谷文萍,1999），誘導(dǎo)熱休克蛋白的合成。在不同條件引起的熱休克反應(yīng)中，熱休克蛋白發(fā)揮著多方面的作用（Martin,1999）。熱休克蛋白超家族(Heatshockproteinsuperfamily)是一類(lèi)進(jìn)化上高度保守的蛋白。這個(gè)家族包括至少6個(gè)

2、亞家族：Hsp110家族，Hsp90家族，Hsp70家族，Hsp60家族，Hsp20家族（小熱休克蛋白家族），泛素（Ubiquitin）等。熱休克蛋白70（Hsp70）家族是熱休克蛋白超家族的重要成員，分子量約為68KD~74KD。熱休克蛋白70除了具有分子伴侶的功能以外，在消除重金屬污染對(duì)機(jī)體造成的損傷（Urani,2001;Ward,2001），調(diào)節(jié)受體數(shù)量（Helen,2001），調(diào)理細(xì)胞凋亡（Chen,2001）等方面都具有重要的作用。近年的研究表明Hsp70還能促進(jìn)抗原提呈，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。在胚胎發(fā)育初期，Hs

3、p70對(duì)胚胎也有一定的保護(hù)作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，Hsp70基因不斷從不同種類(lèi)的生物中被克隆出來(lái)，從而為深入研究Hsp70基因的功能及其表達(dá)調(diào)控規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)大量生物的熱休克蛋白70氨基酸序列進(jìn)行研究表明，熱休克蛋白70家族成員無(wú)論在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，還是在高級(jí)結(jié)構(gòu)上都是高度保守的。因此本課題擬通過(guò)曼氏無(wú)針烏賊Hsp70基因5’端的克隆研究，然后合并分析已知的核苷酸序列，進(jìn)一步進(jìn)行多序列比對(duì)和等電點(diǎn)進(jìn)化分化。為曼氏無(wú)針烏賊Hsp70基因提供分子生物學(xué)方面的參考數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。二、研究的基本

4、內(nèi)容與擬解決的主要問(wèn)題：研究的基本內(nèi)容：1.以cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠純化，連接轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒鑒定后送去生物公司測(cè)序。2.測(cè)序的序列與已知序列合并，對(duì)該核苷酸序列進(jìn)行分析。3.對(duì)已知的核苷酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)和糖基化位點(diǎn)分析。4.對(duì)已知的核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。擬解決的問(wèn)題：克隆出曼氏無(wú)針烏賊Hsp705’端的基因，并對(duì)其進(jìn)行分析，為曼氏無(wú)針烏賊Hsp70基因研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。三、研究的方法與技術(shù)路線(xiàn)：（一）研究方法1RNA提取Trizol法提取RNA：取肌肉組織，液氮冷凍后保存于-8

5、0?℃冰箱中備用。采用Trizol一步法提取RNA，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定純度和濃度，并用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳/EB染色檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量。具體步驟如下：（1）在1.5mlRNase-free離心管中加入1mlTrizol，同時(shí)將其中少許Trizol留在離心管蓋內(nèi)；取50mg左右動(dòng)物組織置于離心管蓋內(nèi)，用烘烤過(guò)的手術(shù)剪將組織徹底剪碎；（2）冰上放置5min，以使核蛋白質(zhì)裂解徹底；（3）每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩混勻30s，冰上放置3min；（4）臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上，12000rpm4?℃離心15m

6、in（離心后，混合物分為淡紅色的酚仿相、中間相和無(wú)色的上層水相，RNA就存在于水相中，水相大約占60%）；（5）將上清液小心轉(zhuǎn)移到RNase-free1.5ml離心管里，加入0.5ml的異丙醇，冰上放置10min；（6）臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上，12000rpm4?℃離心10min（離心后，管底看見(jiàn)膠狀RNA沉淀）；（7）棄上清，用1ml75%酒精洗滌RNA沉淀，7500rpm4?℃離心5min；（8）棄上清，室溫下放置5~10min，使酒精揮發(fā)；（9）加20μlDEPC-H2O溶解，-80?℃保存。2cDNA合成cDNA第一鏈

7、的合成使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，操作步驟如下：（1）在Microtube中配制下列混合液：反應(yīng)液成分體積(μl)CDⅢ2μlRNA0.5~1μlRNAFreedH2O至8μl（2）將Microtube置于PCR儀或水浴鍋中，72?℃變性2min，迅速冰浴退火2min；（3）在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：反應(yīng)液成分體積(μl)RRI（RNA酶抑制劑）1μl5×M-MLVBuffer4μl10MmdNTP2μlM-MLV（逆轉(zhuǎn)錄酶）2μlRNAFreedH2O1μlTotalVolume10μl將上述Micro

8、tube管置于PCR儀或水浴鍋中，經(jīng)42?℃10min，然后加入SMARTⅢ、SMARTⅢ2、SMARTⅢ3各1μl混合后取2μl，經(jīng)42℃90min及75℃10min的反應(yīng)后將其置于-20?℃保存。3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)根據(jù)已獲得的部分核心序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0引