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1、第六章DNA序列分析人類基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)人類基因組計(jì)劃(humangenomeproject,HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的?？傮w計(jì)劃在15年內(nèi)投入至少30億美元進(jìn)行人類全基因組的分析。美國、英國、法蘭西共和國、德意志聯(lián)邦共和國、日本和我國科學(xué)家共同參與。我國承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號染色體短臂上約30億個(gè)堿基的測序任務(wù)。人類基因組線粒體基因組核基因組(約30億個(gè)堿基)基因外序列基因和基因有關(guān)序列約10%約90%專一或中等重復(fù)序列Non-co

2、dingDNA假基因內(nèi)含子基因片段<10%>90%專一的或低拷貝數(shù)序列中度至高度重復(fù)序列20~30%70~80%分散重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列/成簇重復(fù)序列約60%約40%蛋白編碼基因rRNA基因tRNA基因CodingDNA序列測定的技術(shù)雜交測序法質(zhì)譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法DNA芯片法經(jīng)典方法:Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術(shù)方法:與PCR反應(yīng)類似。反應(yīng)體系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTP

3、s和測序引物；反應(yīng)過程：變性－復(fù)性－延伸－終止Sanger雙脫氧終止法Dideoxynucleotides（雙脫氧核苷酸）ddNTPs是反應(yīng)終止劑可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般3~4：1)。*少一個(gè)－OH脫氧核甘酸與雙脫氧核甘酸結(jié)構(gòu)比較HSanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快ddNTPs參與下的DNA復(fù)制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP與dNTP的比例，比例高時(shí)，得到較短的產(chǎn)物；GelElectro

4、phoresisDNAFragmentSizeDeterminationDNA帶負(fù)電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小有關(guān)Sanger第二步：熒光檢測除核苷酸序列文本文件外，全自動測序儀還提供曲線圖。Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在幾組互相獨(dú)立的的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某一種或某一類堿基。因此生成一系列放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的

5、位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標(biāo)記的分子。堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鳥嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應(yīng)。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學(xué)試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基。G反應(yīng)：DMS使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應(yīng)：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，利用哌啶使A、G脫

6、落。T+C反應(yīng)：肼（低鹽）C反應(yīng)：肼（高鹽）測定DNA長度~250bp?；瘜W(xué)裂解法測定DNA的核苷酸序列DNA片斷序列測定的策略測定未知序列的DNA片斷一次測序結(jié)果有長度限制（﹤1000bp)通用引物指導(dǎo)未知序列的測定引物步移隨機(jī)克隆測序缺失克隆測序通用引物指導(dǎo)未知序列的測定根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)通用引物測定待測DNA片斷引物步移策略將待測DNA片斷克隆在質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片斷的一端開始逐步進(jìn)行序列測定，直至另一端為止?？朔锁B槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數(shù)據(jù)分析工作量。但由于測定下一段序列前

7、要預(yù)先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行測序。定向缺失克隆策略、染色體步查法等。鳥槍測序法(shotgunsequencing)：隨機(jī)克隆測序?qū)⒋郎y的DNA片段隨機(jī)打斷并構(gòu)建隨機(jī)重疊克隆文庫，然后通過通用引物測定每個(gè)克隆中的待測DNA序列。當(dāng)這些已測序列的數(shù)量達(dá)到一定程度后，相當(dāng)于待測DNA片斷的每一部位的序列也就被測定出來了，通過這些所測序列之間的重疊部分，最終可將整個(gè)DNA片斷的序列拼接出來，這樣的測序策略稱為隨機(jī)克隆測序。將DNA大片段切割成小片段的三種方法：限制性內(nèi)切酶酶切超聲波處理DNA酶I降解(加M

8、n2+)鳥槍法測序的缺點(diǎn)隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復(fù)測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，導(dǎo)致判斷失誤。完整基因組的測序過程一般包括三個(gè)步驟：（1）建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC（YeastArtificia