《dna測序原理和方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、DNA測序原理和方法DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABIPRISM310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程?！驹怼緼BIPRISM310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的d

2、dNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3''''末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動

3、將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP6)和GeneScan膠(POP4)。這些凝膠顆?？讖骄?，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器

4、，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。【試劑與器材】1．BigDye測序反應(yīng)試劑盒主要試劑是BigDyeMix，內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNT

5、P，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反應(yīng)緩沖液等。2．pGEM-3Zf(+)雙鏈DNA對照模板0.2g/L，試劑盒配套試劑。3．M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。4．DNA測序模板可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時取量1μl為宜。本實驗測定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。5．引物需根據(jù)所要測定的DNA片段設(shè)計正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組

6、質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。6．滅菌去離子水或三蒸水。7．0.2ml或和0.5ml的PCR管蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。8．3mol/L醋酸鈉(pH5.2)稱取40.8gNaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。9．70%乙醇和無水乙醇。10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml無水乙醇和2.5ml3mol/LNaAc混勻，室溫可保存1年。11．POP6測序膠ABI產(chǎn)品。12．模板抑制試劑(TSR)ABI產(chǎn)品。13．10×電泳緩沖液ABI產(chǎn)品。1

7、4．ABIPRISM310型全自動DNA測序儀。15．2400型或9600型PCR儀。16．臺式冷凍高速離心機。17．臺式高速離心機或袖珍離心機?！静僮鞑襟E】1．PCR測序反應(yīng)(1)取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：所加試劑測定模板管標(biāo)準(zhǔn)對照管BigDyeMix　　　　　1μl　　1μl待測的質(zhì)粒DNA　　　　1μl　?。璸GEM-3Zf(+)雙鏈DNA　　?。?μl待測DNA的正向引物　　1μl　?。璏13(-21)引物－1μl滅菌去離子水　2μl　　2μl總反應(yīng)體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋

8、緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃10s，50℃5s，60℃4min，25個循環(huán)，擴增