《ShRNA與SiRNA的綜述》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、RNA干擾（RNAi）是有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的過程，該過程通過雙鏈RNA（dsRNA）使得目標(biāo)基因相應(yīng)的mRNA選擇性失活來實現(xiàn)的。RNA干擾由轉(zhuǎn)運到細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活。沉默機制可導(dǎo)致由小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）誘導(dǎo)實現(xiàn)靶mRNA的降解，或者通過小RNA（miRNA）誘導(dǎo)特定mRNA翻譯的抑制。這篇綜述將重點介紹shRNA和siRNA是如何導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)抑制的。通過幾種蛋白的活性（下面討論），通過短反義核酸（siRNA和shRNA序列）鎖定細(xì)胞mRNA，從而實現(xiàn)其隨后的降解

2、。這反過來阻斷了該蛋白的進(jìn)一步表達(dá)/聚集，導(dǎo)致其水平的下降，最終實現(xiàn)抑制作用。背景調(diào)控途徑的發(fā)現(xiàn)和組成元件圖1.?siRNA和shRNA結(jié)構(gòu)。（A）siRNAs是短的RNA雙鏈，在3‘端有兩個堿基的游離。（B）shRNA由正義鏈和反義鏈通過環(huán)狀序列隔開共同組成。（C）shRNA構(gòu)建用于插入表達(dá)載體。源自[1,?2]。早在1984年人們就發(fā)現(xiàn)反義RNA能夠抑制基因的表達(dá)。1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一個模型來解釋這個觀察。然而，直到1998年，F(xiàn)ire等人發(fā)表了在線蟲RNA干擾的結(jié)果，他們發(fā)

3、現(xiàn)雙鏈RNA在抑制基因表達(dá)方面實際上比單鏈RNA更有效。最終確定小RNA途徑涉及的蛋白質(zhì)組分有許多與RNA干擾途徑一樣。表一總結(jié)了RNA干擾機制的主要元件。它們包括鎖定靶基因的雙鏈RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白質(zhì)（具體來說是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。siRNA?vs.?shRNA作用機制兩個在RNAi途徑的基因沉默中具有實質(zhì)利害關(guān)系的是雙鏈小干擾RNA（siRNA）和基于載體的短發(fā)夾RNA（shRNA）。雖然siRNA和shRNA（圖1

4、）都可用于蛋白沉默，但它們的作用機制有所不同（圖2）。不管是長的雙鏈RNA還是短的約21bp堿基對的雙鏈都能夠直接被轉(zhuǎn)運到組織培養(yǎng)的細(xì)胞中（參見轉(zhuǎn)運機制獲取更多細(xì)節(jié)）。雖然有一些報道提到siRNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時是被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中的，但更普遍的看法是它們在細(xì)胞質(zhì)中聚集。長的雙鏈RNA與Dicer一起形成復(fù)合物，雙鏈特異性的核糖核酸酶III能夠?qū)⑺鼈兲幚沓蓭в袃蓚€游離堿基的長度為21-23nt的siRNA。隨后這些siRNA片段與RISC結(jié)合，RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-結(jié)合

5、蛋白（TRBP）組成。然后RNA的兩條鏈分開，其中一條鏈從復(fù)合物上分離。5'端雙鏈穩(wěn)定性最低的那條鏈被選擇出來，穩(wěn)定的并入沉默復(fù)合物中。shRNA在轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞核中的合成，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，莖區(qū)成對的反義和正義鏈與未配對的成環(huán)核苷酸連接在一起（圖1b和1c）。通過與miRNA的加工相同的RNAi機制，shRNA被加工成siRNA。使用細(xì)菌或病毒載體，shRNA被導(dǎo)入靶細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，在某些情況下，載體可以穩(wěn)定地整合到基因組中。根據(jù)驅(qū)動表達(dá)的啟動子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化轉(zhuǎn)錄。在被Exp

6、ortin-5轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)之前，這些初始的前體結(jié)構(gòu)需要首先用Drosha及其雙鏈RNA結(jié)合伴侶DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA隨后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除發(fā)卡結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生在兩個3‘末端帶有兩個游離堿基的20-25nt的雙鏈siRNA。這一有活性的siRNA隨后被整合到沉默復(fù)合物上去。圖2.?RNAi介導(dǎo)的基因沉默機制。在細(xì)胞核表達(dá)后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中它們與Dicer結(jié)合去除環(huán)狀序列。在這一點上，它們與siRNA

7、的加工方式（以短的雙鏈形態(tài)導(dǎo)入細(xì)胞，然后被Dicer識別）相同。在與RISC結(jié)合并去掉其中一條RNA鏈后，它們識別mRNA占有互補序列，導(dǎo)致其降解。源自[3]?一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA識別靶mRNA和降解的過程基本上是相同的。作為RISC的一部分，siRNA通過堿基互補配對以序列特異性的方式結(jié)合到靶mRNA，從而利用Ago-2的核酸酶H樣活性裂解靶RNA的雙鏈中心附近的磷酸骨架。某些生物的這個系統(tǒng)有一個有趣的特點，siRNA與靶mRNA的退火使siRNA作為引物，而靶mRNA作為依賴于RNA的R

8、NA聚合酶的模板。這就合成出一個新的雙鏈RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反饋循環(huán)，增加了siRNA的量。應(yīng)當(dāng)指出的siRNA通常需要完全同源才能誘導(dǎo)降解。該過程圖2中有闡述。人們對RISC發(fā)現(xiàn)靶mRNA的過程還沒有很好的理解。然而，Ameres等的報告顯示細(xì)胞mRNA的靶序列的親近性影響了它的剪切。他們還指出，RISC不是作用于未折疊的R