《家蠶前纖維蛋白亞細胞定位及其表達的分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。

1、浙江理工大學碩士學位論文家蠶前纖維蛋白的亞細胞定位及其表達分析姓名：徐江濤申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：張耀洲20070301浙江理工大學碩士學位論文摘要前纖維蛋白是一種低分子量肌動蛋白結合蛋白，它的高級結構主要包括三個保守的結合域，分別為肌動蛋白結合結構域，多聚L一脯氨酸結合結構域和磷脂酰肌醇結合結構域，這三個結構域成為前纖維蛋白行使功能的基礎。目前發(fā)現前纖維蛋白在一些細胞過程中如膜轉運、小的GTPase信號途徑、核內活性及神經發(fā)生及分化和腫瘤形成中起重要作用。廣泛存在的前纖維蛋白與很多不同的配體相互作用，包括多聚磷脂酰肌醇、肌動蛋白、肌動蛋白相關蛋白及聚

2、脯氨酸蛋白，前纖維蛋白可能通過特異的方式連接到不同的信號通路。我們從本實驗室構建的家蠶cDNA文庫中獲得家蠶前纖維蛋白cDNA，命名為BmPFN，其開放閱讀框長度381bp，編碼由126個氨基酸殘基組成的肽鏈。經DNAstar軟件計算分子量為13．7kDa，等電點為6．11。多序列比對結果顯示其與赤擬谷盜(Triboliumcastaneum，鞘翅目)的前纖維蛋白同源性最高，126個氨基酸殘基中有105個一致，同源性為83％。設計PCR引入EcoRI和NotI酶切位點，雙酶切連入表達質粒pGEX．5x．1，成功構建重組質粒pGEX．5x．1．BmPFN。將重組質粒轉入BL21(DE

3、3)并誘導表達，經SDS．PAGE鑒定在約40kDa處有明顯的表達條帶，與預測的GST-profilin融合蛋白大小相符。融合蛋白先后經SephadexG50分子篩層析及GST親和柱純化至SDS．PAGE檢測為一條帶。用純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，間接ELISA法測得抗體效價為1：32000，用重組菌表達總蛋白做Westernblotting檢測呈一條帶。利用多克隆抗體對家蠶細胞Bm5進行亞細胞定位研究表明BmPFN主要分布于細胞質中。同時也進行了熒光定量PCR分析不同組織及發(fā)育時期該基因的表達差異，定量內參選用18SrRNA，結果顯示在各組織中絲腺表達量最高，生殖器

4、表達量次之，脂肪體中的表達量最低；在卵、幼蟲、蛹和蛾四個發(fā)育時期中，幼蟲的表達量最高，蛹次之，蛾中較少，卵中表達量最少。RNA干擾實驗顯示BmPFN在家蠶細胞正常的增殖中起重要作用。本論文第一次對家蠶的前纖維蛋白進行了克隆表達及功能的研究，為今后家蠶前纖維蛋白的研究創(chuàng)造了條件。關鍵詞：前纖維蛋白；肌動蛋白；表達分析；．亞細胞定位；定量PCRIII浙江理工大學碩士學位論文AbstractProfilinisakindoflowmolecularweightactinbindingprotein．Itsstructurecomprisethreehighlyconservedbindi

5、ngdomains，whichareactinbindingdomain，poly-L-proline(PLP)stretchesbindingdomainandphosphatidylinostitolbindingdomain，andthethreedomainsarethefoundationofprofilin’Sfunctions．Recentfndingshaveshowntheevidenceofaroleforprofilinsincellularprocessessuchasmembranetrafficking，smallGTPasesignalingandnu

6、clearactivities，inadditiontoneurologicalformationanddifferenciation，tumorformation．Profilinisfoundincytoplasmandalsoinnucleus．Theubiquitousprofilinhasaninteractionwithnumerousligands，includingphosphatidylinostitol，actin，actinrelatedproteins，andproteinsrichinPLP．Atpresentanassumptionisraisedtha

7、tprofilinconnectstootherdifferentsignalpathwaysinaspecifcandselectiveway．TheprofilineDNAfromthesilkwormpupaeDNAlibraryisnamedBmPFN，whoseORFis381bpandcodesaproteinof126aminoacids．ItsmolecularweightcalculatedbytheprogramDNAstaris13．7kDa，a