《家蠶新基因bmx的表達與亞細胞定位的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。

1、浙江理工大學碩士論文摘要在對家蠶蛹eDNA文庫測序中，篩選到一個家蠶未知功能基因BIn-X,通過對其eDNA序列生物信息學分析。該eDNA序列全長為778bp，開放閱讀框(ORF)長444bp，其編碼的蛋白質(zhì)Bm-X，全長147個氨基酸殘基，預測相對分子量為16．4kI)a，等電點為3．69，為無信號肽的非分泌的酸性蛋白。經(jīng)PCR擴增得到Bm-X基因片段，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后，插入相應酶切后質(zhì)粒pET-28a(+)，構(gòu)建重組融合蛋白表達載體pET-28a(+)坦m出經(jīng)PCR、酶切鑒定重組正確。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta(DE3)菌

2、株感受態(tài)細胞，篩選重組菌株后以IPTG誘導表達，裂解菌體作SDS-PAGE分析，在20．1kD處有一濃集的特異性蛋白條帶，表達量可達菌體總蛋白的50％左右。融合蛋白以可溶形式存在，超聲波裂解菌體后離心收集上清液，采用鎳離子親和層析柱純化重組融合蛋白rBm-X。以該融合蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔制備了多克隆抗體，ELISA檢測該抗體血清的效價可達到1：8000以上。Westernblotting檢測表明制備的多克隆血清具有較高的特異性。隨后以多克隆抗體為工具，對Bm-X基因進行亞細胞定位，并分析Bm-X基因在五齡家蠶各組織蛋自和蛹中的表達分布：Bm．X在家蠶

3、BmN細胞的細胞質(zhì)和細胞核中都存在，但是以細胞質(zhì)中居多。Bm-X基因的表達信號主要分布于五齡家蠶中腸、頭部、表皮與脂肪體，在蛹中的信號則相對偏低。關(guān)鍵詞家蠶；新基因；功能基因：表達；細胞定位4浙江理工大學碩士論文AbstractAccordingtothelarge-scalesequencingofeDNAlibraryfromsilkwormpupae，theeDNAofanovelgenewinlblankresearchbackgroundwasidentifiedandtemporarynamedBm-X．ThelengthofthiscDNAi

4、s778bp．Throughbioinformaticsanalysis,wechooseit'sOFFforfurtherstudy．Ithas444．bpandencodes147aminoacidresidues，withthepredictedmassof16．4kDaandpIof3．69．Bm-Xispredictedtobeanon-classicalsecretoryproteinwithriosignalpeptide．ThePCRproductofBm-Xwaspurified，andafterbeingdigestedwithBamH

5、IandXhoI'theDNAfragmentWasinsertedintothefusionexpressionvectorpET-28a(+)．TherecombinantplasmidwastransformedintoE．coliRosseta(DE3)．PCRanddigestionwithBamH11XhoIshowedthatthetargetfragmentwasinsertedcorrectly．RecombinantproteinwasexpressedsuccessfullyinE．coliRosseta(DE3)inducedbyI

6、PTGTheanalysisofSDS—PAGEshowedthatthefusionproteinrBm—XwasexpressedhighlyinRossetafDE3)withsolubleform．ByNi·affinitychromatography,rBm-XWaSpurified．Immunizationofrabbitwithrecombinantproteingeneratedhightiter(1：8000)polyclonalantibodies，measuringbyELISA．Westernblottinganalysisshow

7、edthattheantibodycouldbindrBm—Xspecifically,andthen,subcellularlocation,expressionanddistributionanalysisWasperformed．ItlaidagoodfoundationoffurtherstudiesofthisnovelgeneBm-X．KeyWord：Bombyxmori,novelgene，functionalgene，subcellularlocation5浙江理工大學碩士論文APBm-XBm．XBSAEDTAELISAHRPIPTGKan

8、MCSNCBIORFOPDPCRrBm．XSDS—PAGEPCRP