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    T∕GDSF 0007-2022 南海島礁海域海參生態(tài)增殖技術(shù)規(guī)范.pdf

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    ICS65.150CCSB50GDSF廣東水產(chǎn)學(xué)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/GDSF0007—2022南海島礁海域海參生態(tài)增殖技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationsforecologicalenhancementandofreef-inhabitingseacucumbersinSouthChinaSea2022-11-30發(fā)布2022-12-1實(shí)施廣東水產(chǎn)學(xué)會發(fā)布 T/GDSF0007—2022目次前言..........................................................................III1范圍................................................................................12規(guī)范性引用文件......................................................................13術(shù)語和定義..........................................................................14海域選擇............................................................................1自然條件........................................................................1水質(zhì)理化條件....................................................................15物種選擇............................................................................26種苗培育及苗種要求..................................................................27生態(tài)增殖............................................................................2苗種轉(zhuǎn)運(yùn)........................................................................2適應(yīng)性馴化......................................................................2底播增殖........................................................................28增殖容量............................................................................39海參生物量調(diào)查......................................................................3潛水員和設(shè)備....................................................................3潛水?dāng)嗝嬖O(shè)置....................................................................3海參生物量監(jiān)測與計(jì)算............................................................310生態(tài)增殖效果評估...................................................................3基于海參生物量的增殖效果評估...................................................3基于環(huán)境DNA的增殖效果評估.....................................................4基于增殖群體回捕占比率的增殖效果評估...........................................411管理...............................................................................4附錄A(規(guī)范性)海參生態(tài)增殖放流情況記錄表......................................5A.1海參生態(tài)增殖放流情況記錄表......................................................5附錄B(資料性)基于海參環(huán)境DNA的海參豐度計(jì)算..................................6B.1特異性qPCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì).........................................................6B.2PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒構(gòu)建及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板制備.............................................6B.3DNA標(biāo)準(zhǔn)定量曲線制作.............................................................6B.4環(huán)境DNA的qPCR擴(kuò)增及海參豐度計(jì)算...............................................6附錄C(資料性)基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的海參底播回捕占比率計(jì)算......................7C.1樣本采集........................................................................7C.2樣本保存........................................................................7C.3樣本DNA提取....................................................................7C.4多態(tài)性SSR位點(diǎn)的篩選............................................................7I T/GDSF0007—2022C.5PCR擴(kuò)增及基因分型...............................................................7C.6特定種類海參回捕抽樣樣本的遺傳區(qū)分及回捕占比率計(jì)算...............................7II T/GDSF0007—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由廣東水產(chǎn)學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位:中國科學(xué)院南海海洋研究所、海南大學(xué)、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、廣西科學(xué)院、廣西精工海洋科技有限公司、湛江市東海島東方實(shí)業(yè)有限公司。本文件主要起草人:胡超群、羅鵬、陳廷、鄂子譞、謝珍玉、孫紅巖、陳償、江曉、柯志新、姜發(fā)軍、程楚杭、賴俊翔、張鑫、劉陽、章翔、張呂平、但學(xué)明、宋建強(qiáng)、陳文林。III T/GDSF0007—2022南海島礁海域海參生態(tài)增殖技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了南海島礁海域海參生態(tài)增殖的海域選擇、物種選擇、種苗培育及苗種要求,描述了生態(tài)增殖效果監(jiān)測與評估的方法,提供了海參生態(tài)增殖管理的指導(dǎo)意見。本文件適用于南海島礁海域海參的生態(tài)增殖。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB11607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分:海洋生物調(diào)查SC/T2111淺海多營養(yǎng)層次綜合養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范海帶、牡蠣、海參DB21/T1878農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全刺參人工育苗技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。原生種Originalspecies在無人為干預(yù)的野生環(huán)境下自然演化而來的物種。生態(tài)增殖Ecologicalenhancement采用放流、移植或栽培、底播等人工方式,在生態(tài)系統(tǒng)承載力范圍內(nèi),利用天然生產(chǎn)力增加生物種群產(chǎn)量的過程。適應(yīng)性馴化Adaptivedomestication增殖放流苗種適應(yīng)野外海域環(huán)境的人工培育和處理過程。底播增殖Bottomsowingforstockenhancement通過播撒底棲生物苗種到適合的海底生境,利用天然生產(chǎn)力增加放流種群產(chǎn)量的過程。環(huán)境DNAEnvironmentalDNA是指從環(huán)境樣本中提取的所有DNA的集合,包括環(huán)境微生物以及從生物體上脫落下來的活細(xì)胞DNA和因生物死亡后細(xì)胞破碎而游離出的胞外DNA。4海域選擇自然條件根據(jù)島礁環(huán)境特點(diǎn),結(jié)合歷史資料、捕撈生產(chǎn)信息以及資源生態(tài)環(huán)境的本底調(diào)查資料,針對不同種類的海參,篩選確定海參生態(tài)增殖的海域。增殖海域應(yīng)生態(tài)環(huán)境良好、餌料生物豐富、水流暢通。水質(zhì)理化條件增殖海域的水質(zhì)理化因子應(yīng)符合表1的要求。1 T/GDSF0007—2022表1南海島礁海參增殖海域水質(zhì)理化因子要求水質(zhì)理化因子參數(shù)水溫18℃~35℃鹽度25~35pH8.0~9.0底層溶解氧4.0mg/L~10.0mg/L其它水質(zhì)因子符合GB11607規(guī)定5物種選擇選擇來自南海海域的礁棲海參原生種,禁止采用外來種、雜交種、轉(zhuǎn)基因種以及其他不符合生態(tài)要求的海參物種進(jìn)行生態(tài)增殖。適合南海島礁海域生態(tài)增殖的主要種類為玉足海參(Holothurialeucospilota)、糙海參(H.scabra)小疣刺參(Stichopusmonotuberculatus)和糙刺參(S.horrens)。6種苗培育及苗種要求參照DB21/T1878中的方法進(jìn)行生態(tài)增殖種苗的培育。用于生態(tài)增殖的人工繁育參苗和底播參苗應(yīng)活動力強(qiáng)、外觀無損傷、形態(tài)正常、無畸形、規(guī)格整齊。規(guī)格應(yīng)符合表2的要求。表2南海島礁海參底播生態(tài)增殖苗種規(guī)格規(guī)格等級體重小規(guī)格1g/頭<體重≤2g/頭大規(guī)格體重>2g/頭7生態(tài)增殖苗種轉(zhuǎn)運(yùn)海參苗種從育苗池轉(zhuǎn)運(yùn)至待增殖海域的方法及要求如下:a)在參苗運(yùn)輸桶或塑料袋內(nèi)加入清潔海水,加水高度不超過運(yùn)輸容器體積的2/3;b)從海參育苗池中收集海參苗,以清潔海水沖洗體表,放入?yún)⒚邕\(yùn)輸桶或塑料袋內(nèi),密度控制在小規(guī)格參苗50頭/L~100頭/L,大規(guī)格參苗10頭/L~50頭/L;c)采用敞口運(yùn)輸桶運(yùn)輸參苗,應(yīng)配備充電式移動增氧機(jī)持續(xù)增氧;采用塑料袋運(yùn)輸參苗,應(yīng)向袋內(nèi)充入純氧,氧氣與水體體積比為1:3,并用寬橡皮筯軋緊袋口;d)用敞口運(yùn)輸桶充氣運(yùn)輸時(shí)應(yīng)注意遮蔭,用封閉塑料袋運(yùn)輸時(shí)應(yīng)適當(dāng)降溫;e)將運(yùn)輸桶或塑料袋放入轉(zhuǎn)運(yùn)車內(nèi),運(yùn)送至待增殖海域。適應(yīng)性馴化將海參苗種運(yùn)輸至待增殖海域后,在海域設(shè)置小型網(wǎng)箱,規(guī)格為2m×2m×2m的小型網(wǎng)箱可暫養(yǎng)參苗2萬頭~4萬頭,暫養(yǎng)時(shí)間為3d,每天投喂附近海域的海底表層泥沙(含有機(jī)質(zhì))1次,投喂量為200g/次~1000g/次,第4d不投喂,直接裝運(yùn)至船上進(jìn)行底播增殖。底播增殖7.3.1底播時(shí)間南海島礁海域海參苗種的底播最適宜月份為每年的3月~10月。7.3.2底播天氣2 T/GDSF0007—2022選擇晴朗、多云或陰天進(jìn)行底播生態(tài)增殖,海面最大風(fēng)力≤5級,氣溫≤35℃。7.3.3運(yùn)輸船及暫養(yǎng)桶根據(jù)運(yùn)輸量以及放流海域的水深,選擇合適大小的漁船或快艇作為運(yùn)輸船,運(yùn)輸船應(yīng)有遮陰設(shè)施和配置移動式增氧泵,可平穩(wěn)放置暫養(yǎng)桶,暫養(yǎng)桶體積為100L~300L,每個(gè)暫養(yǎng)桶放置增氧氣石1個(gè)。7.3.4苗種運(yùn)輸以抄網(wǎng)將參苗從暫養(yǎng)網(wǎng)箱內(nèi)撈至裝有清潔海水的暫養(yǎng)桶內(nèi),暫養(yǎng)桶每桶放置參苗5000頭~15000頭,運(yùn)輸至底播預(yù)定海域。7.3.5苗種底播22船速:2m/s~4m/s,投放密度:0.1頭/m~0.2頭/m,苗種底播按照SC/T2111中的方法進(jìn)行,記錄投放中心位點(diǎn)的GPS坐標(biāo)、投放數(shù)量和覆蓋范圍(距中心位點(diǎn)坐標(biāo)的距離),填寫海參增殖放流情況記錄表(參見附錄A)。8增殖容量不超過增殖海域歷史上礁棲海參最大捕撈產(chǎn)量的2倍。9海參生物量調(diào)查潛水員和設(shè)備按GB/T12763.6的規(guī)定進(jìn)行潛水員配備和設(shè)備準(zhǔn)備。潛水?dāng)嗝嬖O(shè)置在生態(tài)增殖海域設(shè)置6個(gè)監(jiān)測斷面,斷面水深10m以內(nèi),每個(gè)斷面寬1.2m,長50m,斷面設(shè)置方法為:在監(jiān)測海域內(nèi),通過潛水設(shè)定起點(diǎn),沿礁石走向拉皮尺至終點(diǎn),起點(diǎn)到終點(diǎn)距離為50m。海參生物量監(jiān)測與計(jì)算潛水員沿皮尺方向進(jìn)行斷面內(nèi)海參數(shù)量調(diào)查,肉眼可見海參個(gè)體均計(jì)入海參數(shù)量,并根據(jù)海參形態(tài)辨別海參種類,進(jìn)行斷面內(nèi)海參數(shù)量統(tǒng)計(jì),調(diào)查海域的海參生物量計(jì)算公式為:????????????????1=10000×(????1+????2+????3+????4+????5+????6)360·····································(1)式中:2SCin1——調(diào)查海域面積內(nèi)觀測的海參生物量,單位為頭/hm;S1——斷面1內(nèi)觀測的海參數(shù)量,單位為頭;S2——斷面2內(nèi)觀測的海參數(shù)量,單位為頭;S3——斷面3內(nèi)觀測的海參數(shù)量,單位為頭;S4——斷面4內(nèi)觀測的海參數(shù)量,單位為頭;S5——斷面5內(nèi)觀測的海參數(shù)量,單位為頭;S6——斷面6內(nèi)觀測的海參數(shù)量,單位為頭。10生態(tài)增殖效果評估基于海參生物量的增殖效果評估基于潛水調(diào)查結(jié)果,根據(jù)底播增殖實(shí)施前后增殖海域和對照海域(未實(shí)施海參增殖的臨近海域)的海參生物量變化來評估生態(tài)增殖效果。底播增殖實(shí)施前增殖海域和對照海域的本底海參生物量分別為BQ1和BQC1;底播增殖一年后增殖海域和對照海域的海參生物量分別為BQ2和BQC2。生態(tài)增殖效果評估值(RQ)計(jì)算公式如下:?????=???????2?????1?/??????????2?????????1??1?×100%··············································(2)3 T/GDSF0007—2022式中:RQ——增殖效果評估值,單位為%;2BQ1——增殖海域的本底海參生物量,單位為頭/hm;2BQ2——實(shí)施一年后增殖海域的海參生物量,單位為頭/hm;2BQC1——對照海域的本底海參生物量,單位為頭/hm;2BQC2——實(shí)施一年后對照海域的海參生物量,單位為頭/hm。按照表3的分級標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行海參生態(tài)增殖效果的分級評估。表3基于海參生物量的生態(tài)增殖效果評估分級增殖效果分級指標(biāo)優(yōu)良一般差增殖效果評估值(RQ)>30%30%≥RQ≥20%20%>RQ≥10%<10%基于環(huán)境DNA的增殖效果評估調(diào)查增殖海域和對照海域的海參環(huán)境DNA豐度(方法參見附錄B),根據(jù)底播增殖實(shí)施前后增殖海域和對照海域海參環(huán)境DNA的豐度變化來評估生態(tài)增殖效果。底播增殖實(shí)施前增殖海域和對照海域的本底海參環(huán)境DNA豐度分別為BE1和BEC1;底播增殖一年后增殖海域和對照海域的海參環(huán)境DNA豐度分別為BE2和BEC2。生態(tài)增殖效果評估值(RE)計(jì)算公式如下:?????=[(?????2?????1)/(?????????2?????????1)?1]×100%··············································(3)式中:RE——增殖效果評估值,單位為%;BE1——增殖海域的本底海參環(huán)境DNA豐度,單位為拷貝/mL;BE2——實(shí)施一年后增殖海域的海參環(huán)境DNA豐度,單位為拷貝/mL;BEC1——對照海域的本底海參環(huán)境DNA豐度,單位為拷貝/mL;BEC2——實(shí)施一年后對照海域的海參環(huán)境DNA豐度,單位為拷貝/mL。按照表4的分級標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行海參生態(tài)增殖效果的分級評估。表4基于環(huán)境DNA的海參生態(tài)增殖效果評估分級增殖效果分級指標(biāo)優(yōu)良一般差增殖效果(RE)>30%30%≥RE≥20%20%>RE≥10%<10%基于增殖群體回捕占比率的增殖效果評估在海參底播增殖實(shí)施一年后,在增殖海域進(jìn)行海參增殖群體回捕,基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的海參底播回捕占比率的計(jì)算方法參見附錄C。按照表5的分級標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行海參生態(tài)增殖效果的分級評估。表5基于增殖群體回捕占比率的海參生態(tài)增殖效果評估分級增殖效果分級指標(biāo)優(yōu)良一般差增殖群體回捕占比率(RH)>20%20%≥RH≥10%10%>RH≥5%<5%11管理海參增殖放流后,應(yīng)定期巡查放流海域,防止非法捕撈增殖放流的海參資源。4 T/GDSF0007—2022附錄A(規(guī)范性)海參生態(tài)增殖放流情況記錄表A.1海參生態(tài)增殖放流情況記錄表海參生態(tài)增殖放流情況記錄表見表A.1。表A.1海參生態(tài)增殖放流情況記錄表增殖放流單位:記錄日期:海參種類放流日期放流人員放流海域氣溫水溫鹽度pH放流數(shù)量規(guī)格放流海域中心位點(diǎn)GPS坐標(biāo)放流海域邊緣坐標(biāo)1放流海域邊緣坐標(biāo)2放流海域邊緣坐標(biāo)3放流海域邊緣坐標(biāo)4放流海域邊緣坐標(biāo)5放流海域邊緣坐標(biāo)6放流海域邊緣坐標(biāo)7放流海域邊緣坐標(biāo)8放流海域邊緣坐標(biāo)9放流海域邊緣坐標(biāo)10放流海域邊緣坐標(biāo)11放流海域邊緣坐標(biāo)12記錄人:核對人:5 T/GDSF0007—2022附錄B(資料性)基于海參環(huán)境DNA的海參豐度計(jì)算B.1特異性qPCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)針對特定海參種類的線粒體COI基因或基因組DNA特異區(qū)域設(shè)計(jì)種特異性qPCR擴(kuò)增引物,引物設(shè)計(jì)的原則為:引物特異性強(qiáng),長度19bp~22bp,GC含量40%~60%,堿基分布均勻,擴(kuò)增片段長度為150bp~200bp。B.2PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒構(gòu)建及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板制備以目標(biāo)海參的DNA為模板,進(jìn)行常規(guī)的海參特異性PCR擴(kuò)增,進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,采用常規(guī)的方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,提取質(zhì)粒,溶于50μLddH2O中,-20℃保存,測量質(zhì)粒的濃度。質(zhì)??截悢?shù)計(jì)算公式為:????????=6.02×1023×????????????×0.66×????????················································(B.1)式中:ST——質(zhì)??截悢?shù),單位為拷貝/μL;CON——質(zhì)粒檢測濃度,單位為μg/μL;NT——質(zhì)粒堿基數(shù)量,單位為bp。B.3DNA標(biāo)準(zhǔn)定量曲線制作12345678將質(zhì)粒分別稀釋至10、10、10、10、10、10、10和10拷貝/μL,作為標(biāo)準(zhǔn)模板,模板量為1μL,進(jìn)行常規(guī)qPCR擴(kuò)增,以測得的Ct值為縱坐標(biāo),以質(zhì)粒模板拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制目標(biāo)海參DNA標(biāo)準(zhǔn)定量曲線。B.4環(huán)境DNA的qPCR擴(kuò)增及海參豐度計(jì)算B.4.1環(huán)境DNA提取使用標(biāo)準(zhǔn)的采水器收集海參生態(tài)增殖海域的底層海水,每個(gè)點(diǎn)采集500mL海水樣品,使用0.22μm濾膜對底層海水進(jìn)行過濾,剪碎濾膜,采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒對濾膜上的生物樣本進(jìn)行DNA提取,提取后的DNA溶于50μLddH2O中,-20℃保存,作為環(huán)境DNA。B.4.2環(huán)境DNA的qPCR擴(kuò)增及特定種類海參DNA的定量以1μL上述提取的環(huán)境DNA為模板,進(jìn)行常規(guī)qPCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為20μL,測量樣品Ct值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得Ct值所對應(yīng)的模板中特定種類海參DNA的拷貝數(shù)。B.4.3基于環(huán)境DNA的海參豐度計(jì)算在調(diào)查海域設(shè)置采樣點(diǎn)6個(gè),采集采樣點(diǎn)的海域底層海水500mL,提取環(huán)境DNA,并按照本文件B.4.2的方法對樣品中特定種類海參的DNA進(jìn)行定量,分別計(jì)為DSC1~DSC6,調(diào)查海域特定種類海參DNA的平均拷貝數(shù)(DSC)即為特定種類海參環(huán)境DNA的豐度值,DSC的計(jì)算公式為:????????????=(????????????1+????????????2+????????????3+????????????4+????????????5+????????????6)6···································(B.2)式中:DSC——調(diào)查海域特定種類海參DNA的平均拷貝數(shù),單位為拷貝/mL;DSC1~DSC6——調(diào)查海域第1個(gè)~6個(gè)采樣點(diǎn)特定種類海參DNA的拷貝數(shù),單位為拷貝/mL。6 T/GDSF0007—2022附錄C(資料性)基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的海參底播回捕占比率計(jì)算C.1樣本采集對于生態(tài)增殖區(qū)的同種類海參,底播增殖前分別采集原生種群和底播苗種群體樣本各50頭~60頭,回捕時(shí)隨機(jī)抽取50頭~60頭回捕樣本。C.2樣本保存樣本采集后,用剪刀剪取一塊200mg~500mg的體壁組織,置于10mL離心管中,加入5mL95%乙醇,常溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室保存。C.3樣本DNA提取采用常規(guī)的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取海參樣本DNA,DNA濃度≥50ng/μL,OD260/OD280=1.8~2.0。C.4多態(tài)性SSR位點(diǎn)的篩選對不同來源的特定種類海參進(jìn)行基因組測序并利用MISA軟件查找具有地理差異的特定種類海參的SSR位點(diǎn),采用PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)引物,對不同來源的特定種類海參基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用遺傳分析儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型,并利用GeneMapper3.2軟件讀取等位基因片段的長度,采用Cervus軟件計(jì)算期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)及多態(tài)性信息含量(PIC),篩選出20個(gè)~30個(gè)具有高度多態(tài)性的特定種類海參的SSR標(biāo)記。C.5PCR擴(kuò)增及基因分型利用本文件C.4中具有高度多態(tài)性的SSR標(biāo)記的特異性引物,對特定種類的海參樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25μL,包括:10×PCRbuffer2.5μL、10mMdNTP0.5μL、高保真PCR酶1U、正向引物(10μM)0.5μL、反向引物(10μM)0.5μL、DNA模板1μL,其余由無菌雙蒸水補(bǔ)足至25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,52℃~58℃退火30s,72℃延伸30s,共32個(gè)循環(huán);72℃再延伸6min。采用遺傳分析儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分型。C.6特定種類海參回捕抽樣樣本的遺傳區(qū)分及回捕占比率計(jì)算C.6.1特定種類海參回捕抽樣樣本的遺傳區(qū)分利用本文件C.5的分型結(jié)果,通過相關(guān)軟件對三個(gè)群體(原生種群、放流苗種和回捕樣本)進(jìn)行遺傳分析,鑒定特定種類海參的回捕抽樣樣本與同種類底播苗種群體和原生種群間的遺傳距離,如回捕抽樣樣本與底播苗種群體具有相似的分子遺傳特征,且聚為一類時(shí),可確定其為底播群體的回捕個(gè)體。C.6.2海參底播回捕占比率計(jì)算統(tǒng)計(jì)特定種類海參回捕抽樣樣本中底播群體的回捕個(gè)體數(shù),并按如下公式計(jì)算海參底播回捕占比率:?????=(????????????????))×100%···························································(C.1)式中:RH——海參底播回捕占比率,單位為%;Cn——特定種類海參回捕抽樣樣本中底播群體的回捕個(gè)體數(shù),單位為頭;Ct——特定種類海參回捕抽樣樣本的總個(gè)體數(shù),單位為頭。7

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