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食品快速檢驗(yàn)方法犓犑２０２１０５水產(chǎn)品中地西泮殘留的快速檢測膠體金免疫層析法２０２１０５３１發(fā)布國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布

1犓犑２０２１０５水產(chǎn)品中地西泮殘留的快速檢測膠體金免疫層析法１范圍本方法規(guī)定了水產(chǎn)品中地西泮膠體金免疫層析快速檢測方法。本方法適用于魚、蝦中地西泮的快速定性測定。２原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中地西泮經(jīng)有機(jī)試劑提取，固相萃取柱凈化，濃縮復(fù)溶后，地西泮與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和檢測卡中檢測線（Ｔ線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（Ｃ線）顏色深淺比較，對樣品中地西泮進(jìn)行定性判定。３試劑與材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為ＧＢ／Ｔ６６８２規(guī)定的二級水。３．１試劑３．１．１甲醇（ＣＨ３ＯＨ）。３．１．２乙腈（ＣＨ３ＣＮ）。３．１．３二水合磷酸二氫鈉（ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）。３．１．４十二水合磷酸氫二鈉（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）。３．１．５氯化鈉（ＮａＣｌ）。３．１．６合成硅酸鎂吸附劑（ＭｇＯ３Ｓｉ），１２５μｍ～５００μｍ。３．１．７石墨化碳黑吸附劑（ＧＣＢ），３８μｍ～１２５μｍ。注：合成硅酸鎂吸附劑和石墨化碳黑吸附劑，顆粒較細(xì)，謹(jǐn)防吸入。３．２參考物質(zhì)地西泮參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、ＣＡＳ號、分子式、相對分子質(zhì)量見表１，純度≥９９％。注：或等同可溯源物質(zhì)。表１地西泮參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、犆犃犛號、分子式、相對分子質(zhì)量中文名稱英文名稱ＣＡＳ號分子式相對分子質(zhì)量地西泮Ｄｉａｚｅｐａｍ４３９１４５Ｃ１６Ｈ１３ＣｌＮ２Ｏ２８４．７４３．３溶液配制復(fù)溶溶液：磷酸鹽緩沖液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），稱?。福埃缏然c（３．１．５）、２．７７ｇ十二水合磷酸氫二鈉（３．１．４）、０．３５２ｇ二水合磷酸二氫鈉（３．１．３），用水溶解并定容至１Ｌ。１

2犓犑２０２１０５３．４標(biāo)準(zhǔn)溶液配制３．４．１地西泮標(biāo)準(zhǔn)儲備液（１００μｇ／ｍＬ）：精密稱取地西泮參考物質(zhì)（３．２）１０ｍｇ，精確至０．０１ｍｇ，置于小燒杯中，用甲醇（３．１．１）溶解，定量轉(zhuǎn)移至１００ｍＬ容量瓶中，再用甲醇（３．１．１）定容，搖勻，配制成１００μｇ／ｍＬ地西泮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，４℃冷藏避光保存，有效期６個月。３．４．２地西泮標(biāo)準(zhǔn)中間液（１μｇ／ｍＬ）：精密量取地西泮標(biāo)準(zhǔn)儲備液（３．４．１）５００μＬ加入５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇（３．１．１）定容，搖勻，配制成１μｇ／ｍＬ地西泮標(biāo)準(zhǔn)中間液，４℃冷藏避光保存，有效期６個月。３．４．３地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作液（１０ｎｇ／ｍＬ）：精密量取地西泮標(biāo)準(zhǔn)中間液（３．４．２）５００μＬ加入５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇（３．１．１）定容，搖勻，配制成１０ｎｇ／ｍＬ地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。３．４．４標(biāo)準(zhǔn)溶液為外部獲取時，管理及使用應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定。３．５材料３．５．１地西泮膠體金免疫層析試劑盒：一般包含金標(biāo)微孔、膠體金檢測卡，適用于水產(chǎn)品，按產(chǎn)品要求保存。３．５．２固相萃取柱：固相萃取柱套筒（１２ｍＬ體積）中塞入篩板，稱?。埃福绾铣晒杷徭V吸附劑（３．１．６）加入柱內(nèi)，使填料密實(shí)且表面水平，再塞入篩板壓實(shí)，即完成固相萃取柱制備。若用于檢測蝦、黃鱔等含色素的樣品，則填料為０．８ｇ合成硅酸鎂吸附劑（３．１．６）、０．１ｇ～０．２ｇ石墨化碳黑吸附劑（３．１．７），混合均勻加入柱內(nèi)，使填料密實(shí)且表面水平，再塞入篩板壓實(shí)，制成固相萃取柱?；蛘呤褂猛惿唐坊滔噍腿≈?。４儀器和設(shè)備４．１電子天平：感量為０．０１ｇ和０．０１ｍｇ。注：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室可獲得符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液時，無需配備感量為０．０１ｍｇ的天平。４．２離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥４０００ｒ／ｍｉｎ。４．３移液器：量程為１０μＬ、２００μＬ、１ｍＬ、５ｍＬ。４．４渦漩儀。４．５氮吹儀。４．６孵育器：可控溫２０℃～２５℃。４．７膠體金讀數(shù)儀（可選）。５環(huán)境條件溫度１５℃～３５℃，相對濕度≤８０％。６分析步驟６．１試樣制備水產(chǎn)品取可食用部分，稱取約２００ｇ具有代表性的樣品，充分均質(zhì)混勻，分別裝入潔凈容器作為試樣和留樣，密封，標(biāo)記。留樣置于－２０℃保存。２

3犓犑２０２１０５６．２試樣提取準(zhǔn)確稱取試樣２ｇ（精確至０．０１ｇ）于１５ｍＬ離心管中。加入０．４ｍＬ水、６ｍＬ乙腈（３．１．２），渦漩混合３ｍｉｎ。加入約０．４ｇ氯化鈉（３．１．５），渦漩混合３０ｓ。４０００ｒ／ｍｉｎ離心３ｍｉｎ，上清液備用。固相萃取柱（３．５．２）使用前加入３ｍＬ乙腈（３．１．２），使乙腈流過并棄去以活化固相萃取柱。將離心管中上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（３．５．２），過柱并用空氣壓力將柱內(nèi)殘留液體全部吹出，收集所有樣液。樣液于４０℃～５０℃水浴氮?dú)獯蹈?，加入３００μＬ?fù)溶液（３．３），渦漩混合３０ｓ，作為待測液。注：可用洗耳球或其他等效裝置產(chǎn)生空氣壓力。６．３測定步驟測試前，將未開封的金標(biāo)微孔和檢測卡恢復(fù)至室溫。吸?。玻埃唉蹋檀郎y液置于金標(biāo)微孔（３．５．１）中，反復(fù)抽吸４～５次，使微孔中試劑充分混勻，于孵育器中２０℃～２５℃孵育３ｍｉｎ。吸取１００μＬ混勻液垂直滴于檢測卡（３．５．１）加樣孔中，于孵育器中２０℃～２５℃反應(yīng)５ｍｉｎ，根據(jù)示意圖判定結(jié)果，在１ｍｉｎ內(nèi)進(jìn)行判讀。６．４質(zhì)控試驗(yàn)６．４．１每批樣品應(yīng)同時進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)?？瞻自嚇討?yīng)經(jīng)參比方法檢測且未檢出地西泮。６．４．２空白試驗(yàn)：稱取同類基質(zhì)空白試樣，按照６．２和６．３步驟與樣品同法操作。６．４．３加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取同類基質(zhì)空白試樣２ｇ（精確至０．０１ｇ）置于１５ｍＬ離心管中，加入１００μＬ地西泮標(biāo)準(zhǔn)工作液（３．４．３），使試樣中地西泮含量為０．５μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步驟與樣品同法操作。７結(jié)果判定要求采用目視法對結(jié)果進(jìn)行判讀，目視判定示意圖如圖１和圖２所示。注：也可使用膠體金讀數(shù)儀判讀，讀數(shù)儀的具體操作與判讀原則參照讀數(shù)儀的使用說明書。７．１比色法７．１．１無效控制線（Ｃ線）不顯色，表明不正確操作或檢測卡無效。７．１．２陽性結(jié)果檢測線（Ｔ線）不顯色或檢測線（Ｔ線）顏色比控制線（Ｃ線）顏色淺，表明樣品中地西泮含量高于方法檢測限，判為陽性。７．１．３陰性結(jié)果檢測線（Ｔ線）顏色比控制線（Ｃ線）顏色深或者檢測線（Ｔ線）顏色與控制線（Ｃ線）顏色相當(dāng)，表明樣品中地西泮含量低于方法檢測限，判為陰性。３

4犓犑２０２１０５圖１目視判定示意圖（比色法）７．２消線法７．２．１無效控制線（Ｃ線）不顯色，表明不正確操作或檢測卡無效。７．２．２陽性結(jié)果控制線（Ｃ線）顯色，檢測線（Ｔ線）不顯色，表明樣品中地西泮含量高于方法檢測限，判為陽性。７．２．３陰性結(jié)果檢測線（Ｔ線）與控制線（Ｃ線）均顯色，表明樣品中地西泮含量低于方法檢測限，判為陰性。圖２目視判定示意圖（消線法）７．３質(zhì)控試驗(yàn)要求空白試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陽性。８結(jié)論當(dāng)檢測結(jié)果為陽性時，采用參比方法進(jìn)行確證。４

5犓犑２０２１０５９性能指標(biāo)９．１性能指標(biāo)計(jì)算方法按照附錄Ａ執(zhí)行。９．２檢出限：０．５μｇ／ｋｇ。９．３靈敏度：≥９９％。９．４特異性：≥９５％。９．５假陰性率：≤１％。９．６假陽性率：≤５％。１０其他本方法所述試劑、試劑盒信息、操作步驟及結(jié)果判定要求是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，應(yīng)對其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。本方法參比方法為ＳＮ／Ｔ３２３５—２０１２《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法液相色譜質(zhì)譜／質(zhì)譜法》（包括所有的修改單）。５

6犓犑２０２１０５附錄犃（規(guī)范性）快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算表性能指標(biāo)計(jì)算方法見表Ａ．１。表犃．１性能指標(biāo)計(jì)算方法檢測結(jié)果ｂ樣品情況ａ總數(shù)陽性陰性陽性犖１１犖１２犖１．＝犖１１＋犖１２陰性犖２１犖２２犖２．＝犖２１＋犖２２總數(shù)犖．１＝犖１１＋犖２１犖．２＝犖１２＋犖２２犖＝犖１．＋犖２．或犖．１＋犖．２顯著性差異（χ２）χ２＝（｜犖１２－犖２１｜－１）２／（犖１２＋犖２１），自由度（犱犳）＝１靈敏度（狆＋）／％狆＋＝犖１１／犖１．×１００特異性（狆－）／％狆－＝犖２２／犖２．×１００假陰性率（狆犳－）／％狆犳－＝犖１２／犖１．×１００＝１００－靈敏度假陽性率（狆犳＋）／％狆犳＋＝犖２１／犖２．×１００＝１００－特異性相對準(zhǔn)確度ｃ／％（犖１１＋犖２２）／（犖１．＋犖２．）×１００注：犖為任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標(biāo)指行，第二個下標(biāo)指列。例如：犖１１表示第一行，第一列；犖１．表示所有的第一行，犖．２表示所有的第二列；犖１２表示第一行，第二列。ａ由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果。ｂ由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。ｃ為方法的檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。本方法負(fù)責(zé)起草單位：江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院。本方法驗(yàn)證單位：浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院、天津海關(guān)動植物與食品檢測中心、南昌海關(guān)技術(shù)中心、江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院。本方法主要起草人：張威、郭平、張文中、沈泓、姚歡、蘭偉、王棟、肖亞兵、占春瑞、萬承波、萬建春。６