《gbt 27644-2011 禽皰疹病毒2型熒光pcr檢測方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、Ics11．220B41a宦中華人民共和國國家標準GB／T27644--2011禽皰疹病毒2型熒光PCR檢測方法Protocolofreal—timePCRfordetectingGallidHepersVirus22011范圍禽皰疹病毒2型熒光PCR檢測方法本標準規(guī)定了禽皰疹病毒2型熒光PCR檢測的操作方法。本標準適用于禽皰疹病毒2型的鑒定及其流行病學調查、診斷、檢疫和監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件GB／T27644—2011下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用

2、于本文件。GB／T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3縮略語下列縮略語適用于本文件。ct值：每個反應管內的熒光信號量達到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數。DNA：deoxyribonucleicacid脫氧核糖核酸。dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate三磷酸脫氧核糖核苷。含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四種脫氧核糖核苷。EDTA；ethylenediarninetetraaceticacid乙二胺四乙酸。GHV2：GallmHepersVirus2禽皰疹病毒2型(馬立克氏病病毒血清1型)。MD：Marek’SDiseas

3、e馬立克氏病。PBS：phosphatebelaneedsolution磷酸鹽緩沖生理鹽水。PCR：polymerasechainreaction聚合酶鏈式反應。Real—timePCR：Real—timepolymerasechainreaction實時熒光聚合酶鏈反應。Taq酶：Thermusaquaticuspolymerase耐熱DNA聚合酶。4試劑4．1試劑級別：除另有規(guī)定，本方法試驗用水應符合GB／T6682規(guī)定的二級水，所用化學試劑均為分析純。4．2禽皰疹病毒2型熒光PCR檢測試劑盒，一20℃保存，組成及使用注意事項參見附錄A。4．3引物和探針序列(

4、產物長度142bp)上游引物：5’CCACCACCTCCCATCTGTAC3’下游引物：5’GACAAGGCTGAGCGTAAAcc3’TaqMan探針：5’AcAcGGcTcGGTAAcAGGAcAcAATG3’，其5’端和3’端分別標記FAM和BHQ(或Tamra或Eclipse)。4．41％肝素鈉，配制方法見B．1，4℃保存。4．5三氯甲烷，常溫保存。1GB／T27644—20114．6異丙醇，使用前預冷至--20℃。4．7無水乙醇。4．875％乙醇，采用無水乙醇和滅菌雙蒸水配制，使用前預冷至一20℃。4．90．01mol／LPBS，pH7．2，配制方法見B

5、．2。5器材和設備5．1無菌注射器，1mL，5mL，10mL，25mL，100mL。5．2一次性無菌塑料袋。5．31．5mL無DNA酶和RNA酶的Eppendorf管。5．40．2mL無DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八聯管或96孔板。5．5熒光PCR檢測儀。5．6高速臺式冷凍離心機，可控溫至4℃、離心速度可達120009以上。5．7振蕩器。5．8研缽。5．9普通冰箱和超低溫冰箱：規(guī)格2℃～8℃，--20℃，一80℃。5．10微量移液器，0此～2pL，lpL～10止，10vL～100兒，20pL～200此，100止～1000pL，并配備與移液器匹配的無DNA酶和

6、RNA酶的吸頭。6樣品的采集和處理6．1樣品的采集6．1．1全血用預先加入1％肝素鈉的無菌注射器直接吸取全血至無菌Eppendorf管中，蓋上管蓋并編號。6．1．2羽毛和組織臟器取待檢羽毛OA根部擠出少量羽髓)、肝臟、腎臟和脾臟樣品裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號，送實驗室。6．2樣品貯運樣品采集后，放人密閉的塑料袋內(一個采樣點的樣品，放一個塑料袋)，于保溫箱中加冰、密封，送實驗室。6．3樣品處理6．3．1全血30009離心30min，取棕黃色層轉人無菌的1．5mLEppendor{管中，加入500pLPBS洗滌，30009離心15min，棄上清，編號備用。

7、6．3．2羽毛或組織臟器取待檢樣品2．0g加入2mLpH7．2的0．01mol／LPBS于潔凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，分裝編號備用。2GB／T27644—20116．4樣本存放制備的樣本在2℃～8℃條件下保存應不超過24h，若需長期保存應置一70℃以下，但應避免反復凍融(凍融不超過3次)，淋巴細胞樣品在2℃～8℃條件下保存。7核酸提取及熒光PCR檢測7．1注意事項實驗室注意事項見附錄C。7．2核酸提取7．2．1取n個滅菌的1．5mLEppendorf管(n為被檢樣品之和)，編號。7．2．2每管加入250pLDNA提取液(參見附錄A)，然后分別加入被檢樣本各2

8、50pL，