《核酸純度檢測.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、最近重新研讀了分子克隆第三版，有一個有趣的小發(fā)現(xiàn)，好像過去沒聽人說過。一般測核酸濃度都是用260nm的光吸收值來決定，同時用260/280的比值來判斷有無蛋白質(zhì)污染。理想的比值是1.8~2.0左右。分子克隆第三版專門提到這種判斷核酸純度的辦法是不可靠的。原因在于蛋白質(zhì)在260nm的消光系數(shù)比核酸小很多，即使有相當(dāng)多的蛋白質(zhì)污染，這個比值還是接近于理想的比值。另外，260/280比值尤其不能用于評判寡聚核甘酸的純度，因為嘌呤的消光系數(shù)比嘧啶大好多，寡聚核甘酸嘌呤嘧啶組成很可能不平均，所以很可能出現(xiàn)很純的樣品260/280比值卻比較小的情況。?你所說的‘

2、消光系數(shù)‘，是否就是吸光值的意思？如果你用連續(xù)波長測過核酸的吸光度時，就會發(fā)現(xiàn)，OD260,恰好是核酸吸光值最大的時候，從200-750,是一條曲線，260時是波峰，而280時，剛好是曲線下降到一半左右時的吸光值。而恰好280又是蛋白質(zhì)的最佳吸收值。如果純的核酸，那曲線就是標(biāo)準(zhǔn)的，260/280就是1.8-2.0之間，如果混有蛋白質(zhì)，多肽，酚之類的雜質(zhì)，那280時的吸收峰就變高了，曲線隨之發(fā)生變形，而260時的吸收峰不變。就如你所說的“原因在?于蛋白質(zhì)在260nm的消光系數(shù)比核酸小很多”，因此260的吸收峰幾乎不變。但280時卻不一樣。這時相反，核酸

3、的消化系數(shù)比蛋白質(zhì)小的多，因此，一旦有污染，280上升很快。因此260/280在有污染的情況下就會變小。所以，用260/280的方法，還是比較可靠的。當(dāng)然更可靠的，就是用200-750的波長，連續(xù)掃描。直接觀察核酸的整條曲線，那比光靠260,280兩個吸收值，肯定要準(zhǔn)確很多。其實平時在我們檢測時，我們也會檢測230,320,兩個值。至于這兩值的作用，我稍后再說。其實有230,260,280,320,這四個點?；旧弦材艽_定下這條曲線的該一段的形狀了。A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8

4、（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。（320差不多也就是那條曲線剛下降到0的時候）。所以，當(dāng)我們檢測260/280后，如果比值在1.8-2.0之間時，我們可以說其純度可以，那OD260的值就有效。否則，OD260的值判為無效。你說的嘌噙與嘧啶的吸光值，確實沒錯。但一般情況下，我們測的都是基因組、tRNA，mRNA、cD

5、NA，所以其CG含量都比較均勻。都適用于這種方法。然而，在測某些CG含量明顯不均勻的情況下，比如人工合成的寡核苷酸、引物，在CG含量過大或者過小的情況下，我們就不能用260/280的方法了。不過一般自已合成的引物，都能保證純度的，買來的引物，或者托公司合成的寡核苷酸，也不需要我們用OD值方法重新測一下。因為產(chǎn)品包裝上寫著多少個OD，序列長度，都非常詳細(xì)，純度也是有保證的。當(dāng)OD260/OD280值=1.8說明所提的DNA質(zhì)粒的純度比較高，所含的RNA或蛋白質(zhì)污染很少，當(dāng)OD260/OD280值>1.8，說明有RNA污染，當(dāng)OD260/OD280值<1

6、.8時,說明所提的DNA中有蛋白質(zhì)或者是抽提時用的苯酚未除凈，樓主所體的質(zhì)粒DNA的260/280在2.0左右，說明有一定的RNA污染，在提質(zhì)粒DNA中，一般是在提完質(zhì)粒后，加入TE溶液時加入一定量的RNA酶。抽提1.5ml大腸桿菌過夜菌液時，最后加入20ul的TE溶液時加入1.5ul濃度為10mg/ml的RNA酶，一般就可以完全去除質(zhì)粒中所含的RNA污染有關(guān)RNA的吸光度說明如下：260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白質(zhì)等有機(jī)物的吸光度值。OD260/OD280（R）體現(xiàn)了RNA中的

7、蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染程度，質(zhì)量較好的RNA的R值應(yīng)在1.8～2.0之間，當(dāng)R<1.8時，溶液中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物的污染比較明顯；當(dāng)R>2.2時，說明RNA已經(jīng)被水解成了單核苷酸。在對核酸進(jìn)行吸光度檢測時，需要注意稀釋液應(yīng)使用TEBuffer。