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1、核酸雜交檢測技術(shù)核酸雜交技術(shù)是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一,近年來正逐漸用于病毒病的特異、敏感和快速診斷。雜交的基本原理是堿基互補的二條單鏈核酸退火形成雙鏈。用于診斷目的的雜交雙方是已知序列的病毒探針和待測樣品中的病毒核酸,雜交后通過特定方法檢測。如有雜交信號,則說明樣品中存在病毒核酸,進而證明病毒感染的存在。待測的病毒核酸可以從病料中提取,也可以從純化的病毒粒子提取。提取后可在膜上與探針雜交(固相雜交)?；蛑苯釉谠嚬艿碾s交液中雜交(液相雜交),此外,也可直接在組織切片或細胞涂片上對細胞中的病毒核酸進行雜交(原位雜交)。下面重點介紹如何建立雜交體系及適用于病

2、毒診斷的幾種雜交方法。(一)建立雜交體系核酸雜交是多種環(huán)境因素與二條互補核酸鏈綜合作用的結(jié)果,它有較高的技術(shù)要求。了解各種組份及反應(yīng)條件對雜交的影響是建立雜交體系,獲得理想結(jié)果的基礎(chǔ)。1、溫度雜交反應(yīng)中,雙鏈核酸的變性與復(fù)性主要是溫度控制的。選擇適當?shù)碾s交和洗膜溫度是實驗成敗最關(guān)鍵的因素之一。雜交反應(yīng)通常在低于解鏈溫度(Tm值)15～25℃的條件下進行。Tm值受核酸鏈組成(G+C)、溶液的離子強度、pH值及反應(yīng)體系是否含變性劑等的影響。在雜交體系不含變性劑的情況下,DNA之間的雜交反應(yīng)通常在68℃進行,當含50%變性劑甲酰胺,則在42℃進行

3、。2、pH值雜交體系的pH在5～9的范圍內(nèi)對復(fù)性無明顯影響。雜交反應(yīng)通常在pH65～75之間進行。較高的pH值產(chǎn)生更嚴格的雜交條件。3、鹽離子濃度體系中往往加入單價離子的鹽,因為單價陽離子與核酸鏈上的磷酸基團發(fā)生靜電反應(yīng),所以能降低核酸鏈之間的靜電排斥,維持雙鏈DNA的穩(wěn)定性。鹽濃度增加,穩(wěn)定性提高。雜交體系中通常采用6倍SSC(1倍SSC為015mol/LNaCl和0015mol/L檸檬酸鈉，pH70)緩沖液。4、變性劑雜交體系中加入變性劑可降低Tm值,所以雜交可在更低的溫度下進行。常用變性劑是甲酰胺。5、DNA濃度濃度愈高,

4、復(fù)性速度愈快。所以雜交反應(yīng)中應(yīng)加入足夠的探針,還應(yīng)盡量減少雜交體積,一般每百cm2濾膜用25ml雜交液。6、探針長度溶液中DNA復(fù)性率與片段長度的平方根成正比。所以用長的探針可獲得高的復(fù)性率。但原位雜交通常用較短的探針,以減少探針進入細胞并擴散到靶核酸的阻力。7、硫酸葡聚糖在水溶液中,此化合物表面可吸附DNA探針分子,從而濃縮探針,促進二條核酸鏈間的締合。其10%的濃度可提高雜交速度10～100倍。使用硫酸葡聚糖可能導(dǎo)致背景加深,所以一般在探針濃度過低的情況下才使用。8、雜交時間它受探針的長度與濃度、反應(yīng)體積等因素的影響,較短的探針、較高的

5、探針濃度和較小的雜交體積,需要較短的雜交時間。一般來說,雜交時間通常在2～16小時。9、預(yù)雜交在雜交前進行預(yù)雜交,封閉非特異的DNA結(jié)合位點,降低非特異雜交,是雜交的前提。常用的封阻試劑有非特異性的DNA(鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA)和大分子化合物(聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脫脂奶粉等)。10、堿基錯配雜交中堿基錯配將明顯提高雜交本底,從而影響雜交結(jié)果的判定。因此雜交可在更為嚴格的條件下進行,如低于Tm值15℃的溫度下雜交。11、漂洗雜交后的漂洗是減少非特異雜交,降低本底的關(guān)鍵步驟。通常用較低鹽濃度(01倍SSC)的緩沖液在

6、較高溫度下(如68℃)漂洗雜交膜。(二)核酸打點雜交1、操作步驟核酸打點雜交是最常用的一種雜交檢測方法,是作為診斷目的的首選方法。它是將一定量的病毒核酸(DNA或RNA)打點在固相支持膜(通常是硝酸纖維素膜或尼龍膜)上,然后與放射性或非放射性標記的(DNA或RNA)探針進行雜交,雜交后通過放射自顯影(檢測放射性探針)或顯色反應(yīng)(檢測非放射性探針)檢測雜交信號。陽性雜交信號表明病毒核酸的存在,檢測出病毒核酸就充分說明發(fā)生了病毒感染。具體操作方法如下:①裁剪一張大小適度的硝酸纖維素膜(NC膜),將膜在去離子水中濕透(不能完全濕透的膜不宜使用),再置

7、20倍SSC中浸泡30分鐘,然后置濾紙上,室溫晾干;②取變性的病毒核酸(DNA或RNA)1～5μl點樣于上述處理的NC膜上,同時點上探針同源核酸(作為陽性對照)和非同源核酸(作為陰性對照);③室溫干燥后,將點樣的NC膜置80℃干烤固定2小時;④點樣膜用6倍SSC,01%十二烷基肌氨酸鈉,002%SDS,1%封阻試劑(一種特殊提純和處理的脫脂牛奶粉,柏林格公司生產(chǎn))的預(yù)雜交液于68℃預(yù)雜交4～6小時。每100cm2膜用至少20ml預(yù)雜交液;⑤將膜用雜交液(預(yù)雜交液中加入20～80ng/ml變性的探針)于68℃雜交12～16小時。每100cm2

8、膜用25ml雜交液;⑥室溫下用2倍SSC,01%SDS溶液洗