《膠體金免疫層析法快速檢測(cè)遲鈍愛德華氏菌》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、’游誦學(xué)韋０３００９０３４９±學(xué)＜ｉｉ論文＊ＶＩ膠體金免疫層析法快速檢測(cè)遲鈍ｉｔｉＳＳ目：—Ｉ—－－■？■愛德華穿氏茵—海洋生物學(xué)學(xué)科專業(yè)：病原檢洩！Ｉ研究萬向：論文作者：劉和松指導(dǎo)教師：張?jiān)d教授．？■定稿２〇１２〇４Ｉ９日期：年月日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，。ｉ允許論文被查閱和借閱本人授權(quán)華東理工大學(xué)可ｙ？將本學(xué)位論文的、全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可Ｗ采用影印

2、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文。保密論文在解密后遵守此規(guī)定。論文涉密情況：＾不保密□保密，保密期（年月日至年月日）＿＿＿＿＾＿＿＿＿學(xué)位論文作者簽名：么、指導(dǎo)老師簽名；曰期）；興古年ｒ月曰曰期年ｆ巧曰ｉ誠(chéng)７９３分類號(hào)：Ｑ密級(jí)＝公開ＵＤＣ：華東理工大學(xué)學(xué)位論文膠體金免疫層析法快速檢測(cè)遲純愛德華氏菌劉和松指導(dǎo)教師姓名：張?jiān)d（教授）肖猜凡（博１華東理工大學(xué)，上海市梅陳路３０號(hào)２０膽３７：碩±專業(yè)名稱申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：海洋生物學(xué)論文定稿日期：２０１２．４．１９論文答辯日期：學(xué)位授予單位；華東理

3、工大學(xué)，學(xué)位授予日期：答辯委員會(huì)主席；評(píng)閱人：作者聲明我鄭重聲明；本人恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的結(jié)果。除了文中明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，并對(duì)所寫內(nèi)容負(fù)責(zé)。論文作者簽名；如和卞ｔ＼２０１２年４月１９日華東理工大學(xué)碩±學(xué)位論文第Ｉ頁膠體金免疫層析法快速檢測(cè)巧純愛德華巧菌摘要’遲鈍愛德華氏菌妨ＨＷ妃化Ｗａ一（ｚｅ航！）是種重要的魚類病原菌，由它引起的遲純愛德華氏菌病對(duì)海水魚和淡水魚都具有很

4、高的致死率。為了及時(shí)采取有效措施控制遲純愛德華氏茵病的暴發(fā)，迫切需要建立便捷、準(zhǔn)確的方法對(duì)広ｔｏＷａ早期感染進(jìn)行快速準(zhǔn)確的診斷。本課題制備了Ｅｔｏｎ虹單克隆抗體和多克隆抗體，并用其制備了ｔｏｒ舶檢測(cè)試紙條，同時(shí)將此方法與斑點(diǎn)雜交和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法進(jìn)行了比較。用巧樣酸還原氯金酸的方法制備了各種不同粒徑的膠體金溶液，并用可見光譜和透射電鏡評(píng)價(jià)了膠體金溶液的分散性、形狀Ｗ及粒徑分布。選擇粒徑為３０ｎｍ的膠體金顆粒標(biāo)記Ｅｔｏｎ沁多克隆抗體，并將其吸附至玻璃纖維素膜上，將ＥｆａＷａ多克隆抗體和羊抗兔二抗包被于分析膜上預(yù)定的檢測(cè)線（巧和質(zhì)控線（Ｃ）上，然后將

5、金標(biāo)墊、樣品墊、＾。ａＷｆｌ分析膜＾＾＾及吸水墊組裝成檢測(cè)試紙條該試紙條對(duì)ｆ特異性良好，檢測(cè)蘭株與其他環(huán)境常見細(xì)菌無交叉反應(yīng)７化施均為陽性結(jié)果。該試紙條檢測(cè)限為１０ＣＦＵ／ｍｌ，５？ｍｎ（３１０ｉ內(nèi)），延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間后可達(dá)到１０ＣＦＵ／ｍｌ。自漁場(chǎng)采集疑似罹患遲純愛德華氏菌病的大菱解腹水，Ｗ試紙條檢測(cè)結(jié)果為陽性，同時(shí)采用傳統(tǒng)生理生化和１６ＳｒＤＮＡ測(cè)ｓ？５ｘ序簽定該大菱輯確為Ｅｔｏ，麻感染，且腹水中該菌濃度為ｌ〇ＣＦＵ／ｍｌ。為提高檢測(cè)試紙條的靈敏度，制備了丘ｔｏｎ沁單克隆抗體。提取ＥｔｏＷａ外膜蛋白，并用其免疫Ｂａ／ｃ小鼠。經(jīng)Ｈ次免疫后，選擇血清中

6、抗體ＥＬＩＳＡ效價(jià)較離的兩只小鼠，ｌｂ。制備分散的脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行兩次融合經(jīng)過篩選和克隆，獲得了兩株能夠穩(wěn)定分泌具有良好特異性和親和力單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將這兩株雜交瘤經(jīng)培養(yǎng)后．ｔｏＷａ單克隆。，注入小鼠腹腔產(chǎn)生腹水。抽取的腹水經(jīng)蛋白Ｇ親和純化得到￡抗體經(jīng)亞型鑒定分析，二者均為ＩＧ。ｇ２ｕ經(jīng)抗體匹配實(shí)驗(yàn)后，用膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體，并將其吸附至玻璃纖維素膜上，將單克隆抗體和羊抗鼠二抗包被至分析膜上預(yù)定的檢測(cè)線ＣＯ與質(zhì)控線（Ｃ），然后將金標(biāo)墊、樣品墊、分析膜和吸水墊組裝成檢測(cè)試紙條。經(jīng)過優(yōu)化后，該檢測(cè)試紙５條的靈敏度達(dá)到ｘ￣５ｌ〇

7、ＣＦＵ／ｍｌ３１０ｍｉｎ，內(nèi)即可觀察結(jié)果，特異性良好，與其他海水及？沁魚類常見細(xì)菌無交叉反應(yīng)，檢測(cè)２０株左．ｔｏ，，陽性檢出率為１００％。為評(píng)價(jià)所制備的檢測(cè)試紙條的性能，將試紙條檢測(cè)方法與斑點(diǎn)雜交和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)５５增方法進(jìn)行了比較。試紙條的檢測(cè)限５Ｘ１０ＣＦＵ／ｍｌ雖高于斑點(diǎn)雜交（ＩｘｌＯＣＦＵ／ｍｌ口環(huán)（）巧３介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)増〇ｘｉ〇ＣＦＵ／ｍｌ），但是試紙條檢測(cè)方法方便快捷，可于樣品采集現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行？檢測(cè)操作理其他試劑和昂貴的儀器設(shè)備，在３１０