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1、鄭州大學碩士學位論文GATA轉(zhuǎn)錄因子對心肌能量代謝及細胞增殖的調(diào)控機制研究姓名：姚春霞申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：臧明璽201205摘要GATA轉(zhuǎn)錄因子對心肌能量代謝及細胞增殖的調(diào)控機制研究博士研究生：姚春霞導師：臧明璽鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院河南省鄭州市450001研究背景與目的：心臟具有生成ATP的巨大潛能以滿足對能量的高度需求。在胚胎時期及心肌肥大發(fā)生時，心臟主要依賴葡萄糖和乳糖作為底物產(chǎn)生ATP，而在出生后及成人心臟則主要依賴脂肪酸作為底物產(chǎn)生ATP而獲得能量。由于心肌的脂質(zhì)和葡萄糖儲存能力有限，因此，它們作為底物的選擇及ATP的生成是受到快速調(diào)節(jié)的，以迅速

2、適應心臟的能量需求。這一調(diào)節(jié)過程涉及到多種基因不同時間的先后表達和相互作用，它們形成一個有序的網(wǎng)絡(luò)。該調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)包括大量的，在時間和空間上極為精確的一系列分子事件。在這個過程中，哪怕是極微小的錯誤都將導致心肌能量代謝障礙的發(fā)生，而心肌能量代謝障礙，如線粒體脂肪酸氧化活性的降低，造成ATP產(chǎn)量減少，將會導致心泵功能、收縮功能及鈣離子的轉(zhuǎn)運功能等失調(diào)，從而誘發(fā)心肌肥大和心力衰竭等。因此，深入研究心肌能量代謝關(guān)鍵基因的調(diào)控機制，將有助于從分子水平闡明心血管疾病的分子機理和病理學基礎(chǔ)，同時也可為心血管疾病的臨床防治和新藥設(shè)計提供更多線索。那么，涉及心肌能量代謝的關(guān)鍵基因有什么呢?Glut4是調(diào)

3、節(jié)心肌能量代謝的一個基因，它是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員，維持著機體葡萄糖的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。Glut4的表達具有組織特異性并受到激素調(diào)節(jié)，Glut4基因敲除小鼠出現(xiàn)心肌肥大癥狀。因此，Glut4是調(diào)節(jié)心肌能量代謝的關(guān)鍵基因之一。鑒于此，Glut4作摘要為心肌能量代謝的關(guān)鍵基因，其表達的降低或上調(diào)，對于心肌能量代謝的調(diào)節(jié)具有重要的生理或病理意義，所以研究其調(diào)控機制，是心血管分子生物學領(lǐng)域的重要課題。那么，參與心肌能量代謝的轉(zhuǎn)錄因子有哪些呢?過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferatoractivatedreceptors，PPARs)是調(diào)節(jié)編碼脂肪酸B一氧化相關(guān)酶類

4、基因的重要轉(zhuǎn)錄因子，它包含三種異形體：PPARa、P吶和PPARS／p。這三種異形體都在心臟中表達，與PPAR丫相比，PPARa和PPAR5／13在心肌細胞中的表達更為豐富。研究表明，心臟特異性過表達PPARa將誘導與脂肪酸利用有關(guān)的基因表達，進而增強心臟脂肪酸的利用和氧化：PPARS／p基因敲除小鼠嚴重地損害心肌脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達，增加心臟脂肪酸堆積，從而誘發(fā)脂毒性。因此，PPARs在調(diào)節(jié)心肌能量代謝中發(fā)揮著重要作用。GATA蛋白是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，因其識別序列(朋)GATA(A／G)而得名。在該家族6個成員中，GATA4和GATA6是近年來心血管領(lǐng)域的研究熱點。大量的

5、研究證明GATA4和GATA6是調(diào)控心臟發(fā)育以及心肌細胞增殖、分化和凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。但它們是否在心肌能量代謝中發(fā)揮調(diào)控作用，目前知之甚少。MicroRNAs(miRNAs)是進化上高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，通過轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)控靶基因的表達。近年來的研究表明miRNAs是心臟基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個重要組成部分，但miRNAs是否作用于GATA蛋白與PPARs，進而對細胞的表型產(chǎn)生影響，目前還鮮有報道。因此，本課題以GATA轉(zhuǎn)錄因子為中心，采用多種方法深入研究了GATA6、PPARa、miR-200b以及GATA4對心肌能量代謝和細胞增殖的調(diào)控機制。研究方法與結(jié)果：第一部分：

6、轉(zhuǎn)錄因子GATA6招募PPARa協(xié)同激活Glut4基因的表達為進一步了解GATA家族對心肌能量代謝的調(diào)控作用，采用了瞬時轉(zhuǎn)染、Q-PCR、熒光素酶報告基因、WesternBlot、ColP、GSTpull—down和Chm等實驗方法，證實了在PPARa激動劑fcnofibrate刺激的心肌細胞中，轉(zhuǎn)錄因子GATA6能夠招募核受體PPARa至葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut4啟動子的GATA元件上，這種招募能夠進一步激活Glut4基因的表達，并且伴隨著線粒體功能的促進及葡萄糖利用的增加。WesternBlot及Q-PCR實驗顯示GATA6或PPARa及其激動劑fenofibrate都¨摘要能夠刺

7、激Glut4基因的表達，若二者共表達則可以產(chǎn)生更強烈的激活效應，說明GATA6和PPARa協(xié)同激活Glut4基因轉(zhuǎn)錄。CoW實驗證實GATA6和PPARa相互作用。GSTpull-down實驗顯示GATA6的C端鋅指和PPARa的N端鋅指介導二者間的相互作用。ChIP及熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證實GATA6通過與PPARa蛋白的N端TAD和鋅指結(jié)構(gòu)域相互作用，招募PPARa至Glut4啟動子從而協(xié)同激活Glut4基因的表達，促進線粒體的功能及葡萄糖的利用