《熒光定量pcr引物設計要求》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、熒光定量PCR引物設計要求熒光定量PCR引物的具體設計要求：1.引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。2.產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)(自由能小于58.61KJ/mol)。3.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。4.G+C含量在40%~60%之間，45-55%最佳。5.堿基要隨機分布，盡量均勻。6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。8.引物5′端可以修飾。9.3′端不可修飾，而且要避開AT,GCr

2、ich的區(qū)域，避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)(2-3個)。10.引物3′端要避開密碼子的第3位。11.引物整體設計自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo6軟件進行比對看結(jié)果的情況。12.做熒光定量產(chǎn)物長度80-150bp最好，最長是300bp.13.引物設計避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。14.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小于70%或者有8個互補堿基同源。15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似。16.TM值在58-62度之間。17.引物設計的軟件Prime

3、r5.0有專門針對熒光的。ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGA

4、AGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5'GAGAAGGAATACAC

5、ACCCGAGC3'5'GACCACAAAGTCAGCCCCAG3'ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAG

6、ACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAACGAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGT

7、GGAAG5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG3'5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GCACAGTTGTCATAAGACCCTCAAC3'5'GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'5'GACCCTCAACAATGCCAAACC3'5'CAACGAGAAGGAATACACACC3'5'ACCCTCAACAATGCCAAAC3'TKGAPDH內(nèi)參qRT-PCR引物的設計如下：1.119bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCA

8、CCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGA